复合多糖对小鼠免疫功能及抗应激能力的影响

山东宝来利来生物工程股份有限公司 廉新慧 谷 巍 刘凤芝

近年来研究发现，生物活性多糖可参与各种生命活动调节，激活免疫细胞，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤，提高机体免疫力等作用。因此，研制生物活性多糖免疫调节剂是生物医药发展的重要方面之一。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种 产朊假丝酵母、蛹虫草、灵芝，均由宝来利来生物研究院提供。

1.1.2 试验动物 清洁级纯昆明种小鼠，体重（18±2）g，购自泰邦生物工程有限公司实验动物中心。

1.2 试验方法

1.2.1 产朊假丝酵母培养基 斜面培养基：葡萄糖2%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，琼脂1.6%，水，自然pH。种子培养基和发酵培养基：不加琼脂，其余同斜面培养基。

1.2.2 酵母菌的发酵培养 取出于4℃保藏的菌种，接于斜面培养基中，在30℃下培养 48 h，进行活化。将已活化的菌种，接于已装有种子培养基的三角瓶中于30℃、180 r／min摇床培养48 h，进行种子的扩大。将培养液离心，收集菌泥，干燥，称重，计算生物量。

1.2.3 酵母胞壁多糖的提取 酵母溶解，冻融，超声波破碎（吴小刚等，2006）。

1.2.4 蛹虫草和灵芝的培养 培养方法同酵母菌，培养基为土豆20%，葡萄糖2%，磷酸氢二钾0.3%，硫酸镁0.15%，维生素B15～10 mg/L，pH 6.0，虫草 25℃、灵芝 28℃培养48 h，培养液待用。

1.2.5 黄芪多糖的制备 用水煎法生产制备 （王志俊，2010）。

1.2.6 多糖含量的测定 对酵母菌破壁后的悬浊液、蛹虫草菌丝体的培养物、灵芝菌丝体的培养物、黄芪水煎液用苯酚-硫酸法测多糖含量（张青和张天民，2004）。

1.2.7 动物分组及给药 将小鼠随机分为4组，每组40只，雌雄各半。4种多糖等量复配，分为3个剂量组，Ⅰ组：低剂量组（35 mg多糖/kg体重），Ⅱ组：中剂量组（70 mg多糖/kg体重），Ⅲ组：高剂量组（140 mg多糖/kg体重），对照组灌胃生理盐水（龚晓健，2000）。根据体重按设定的剂量每天定时灌胃1次，自由采食，饮水（杨铁虹等，2005）。试验期为30 d。

1.2.8 小鼠生长状况及增重率 观察体毛、神志、饮食及活动情况。试验期每隔10 d测一次小鼠体重。

1.2.9 免疫指标测定

1.2.9.1 免疫器官指数的测定 分别在试验开始后11、21、31 d，称重后处死小鼠，取出胸腺和脾脏分别称湿重，然后计算胸腺和脾脏指数。胸腺或脾脏指数=胸腺重或脾重/体重。

1.2.9.2 巨噬细胞吞噬功能的测定 分别于试验开始第11、21、31天饲喂后1 h，每只小鼠腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.5 mL，8～12 h后处死，取腹腔液涂片，37℃温孵30 min，漂洗，晾干。用姬-瑞氏混合液染色，并计算吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬百分率/%=（吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/200个巨噬细胞）×100；

吞噬指数/%=（被吞噬的鸡红细胞总数/200个巨噬细胞）×100。

1.2.9.3 外周血液免疫球蛋白IgG含量的测定分别在试验开始后11、21、31 d，小鼠眼球采血1 mL，收集血清，采用小鼠 IgG酶联免疫分析（ELISA）试剂盒测定。

1.2.10 小鼠抗应激能力的测定

1.2.1 0.1 对小鼠常压耐缺氧的影响 雌、雄小鼠各5只，于末次给药30 min后，将小鼠放入存有钠石灰的密闭容器内，立即计时，以呼吸停止为死亡时间。

1.2.1 0.2 对小鼠游泳时间的影响 雌、雄小鼠各5只，于末次给药30min后，将每只小鼠负重0.05g/g，置于20℃的水箱内，水深20 cm，计时至小鼠沉入水中的时间为游泳时间。

1.2.1 0.3 对小鼠耐高温能力的影响 雌、雄小鼠各5只，于末次给药30 min后，将小鼠置于46～50℃的烘箱内，观察并记录小鼠的存活时间。

1.3 数据处理 试验数据采用SPSS软件进行统计分析。

3 结果与分析

3.1 多糖含量测定结果 由表1可见，黄芪的多糖含量最高，其次是虫草菌丝体多糖，酵母胞壁多糖和灵芝菌丝体多糖含量最低。

表1 多糖含量测定结果 mg/mL

3.2 小鼠生长状况和增重率变化 各组小鼠在实验前后进食量、进水量正常，被毛光泽、活动良好，反应敏捷，说明不同剂量复合多糖对小鼠生长状况无不良影响。增重率变化见表2。

表2 小鼠增重率的变化 %

由表2可知，与对照组相比，各试验组增重率显著提高（P＜0.05）。在31 d时Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ剂量组分别显著提高4.13%、11.19%、26.19%。

3.3 小鼠免疫指标测定结果

3.3.1 小鼠免疫器官指数的变化 由表3可知，对胸腺指数的影响，与对照组相比，Ⅰ组在21、31 d较对照组，分别提高9.82%和11.15%（P＜0.05）；Ⅱ组在11、21、31 d时较对照组分别提高9.27%、19.64%、20.77%（P ＜ 0.05）； Ⅲ组在 11、21 d和31 d时较对照组分别提高11.22%、29.02%、23.85%（P ＜ 0.05）。

表3 小鼠免疫器官指数的变化 mg/g

对脾脏指数的影响，与对照组相比较，Ⅰ组没有显著变化（P＞0.05）；Ⅱ组在21 d时较对照组提高5.6%（P＜0.05）（P＞0.05）； Ⅲ组在21 d和31 d较对照组分别提高9.26%和10.13%（P＜0.05）。

3.3.2 小鼠巨噬细胞吞噬功能的变化 由表4可知，对吞噬百分率的影响，各试验组均显著高于对照组（P＜0.05），在31 d时，分别较对照组提高26.05%、55.23%、72.47%。对吞噬指数的影响，各试验组均显著高于对照组（P＜0.05），在31 d时，分别较对照组提高11.36%、26.67%、40.32%。

表4 小鼠巨噬细胞吞噬功能的变化%

3.3.3 小鼠外周血液免疫球蛋白IgG含量的变化由表5可知，对IgG含量的影响，与对照组相比，Ⅰ组未产生显著变化（P＜0.05）；与对照组相比，Ⅱ组在11d时显著提高9.06%（P＜0.05）；Ⅲ组在11、21、31 d时分别显著提高9.90%、12.28%、10.92%（P ＜ 0.05）。

表5 小鼠IgG含量的变化 μg/mL

3.4 复合多糖对小鼠抗应激能力的影响 由表6可知，各试验组与对照组相比，小鼠的常压耐缺氧时间，游泳时间，耐高温时间均显著延长 （P＜0.05）。

表6 多糖对小鼠抗应激作用的影响min

4 讨论

4.1 对小鼠生存状况及体增重的影响 多糖能够明显加快动物的生长，提高动物体增重，其机制是，当多糖提高动物的免疫功能之后，必然会增强动物对外来病原的抵抗作用，从而促进动物的生长。有研究表明，在饲料中添加冬虫夏草能提高机体免疫功能，促进鸡生长，提高饲料转化率，节约单位增重的耗料量 （刘正远等，2006；魏建忠，2005）。本试验结果显示，与对照组相比，三组复合多糖均能显著提高小鼠的增重率。

4.2 对小鼠免疫器官指数的影响 胸腺和脾脏是动物的重要免疫器官。免疫器官的重量在一定程度上可反映免疫器官内淋巴细胞的数量，当动物处于应激反应衰竭期时，胸腺、脾脏及体重也相应降低，因此测定动物体重、胸腺及脾脏重量指数可反映机体免疫能力。本试验结果可见，各试验组胸腺指数和脾脏指数均有所增加，中、高剂量组，增加明显。 这与姚庆志等（2011）的试验结果一致。

4.3 对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 巨噬细胞是一种典型的炎症细胞，对激活剂有很高的敏感性，在微量激活剂的作用下，巨噬细胞体积可增大，吞噬活力增强。因此，吞噬细胞吞噬活性大小在一定程度上反映了机体的非特异性免疫功能。利用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的数量，可在体外观察巨噬细胞的吞噬功能。龚晓健等（2000）研究表明，人工虫草胞内及胞外多糖均有增强单核巨噬细胞吞噬功能的作用。本试验结果也显示，不同剂量复合多糖均能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数（P＜0.05）。

4.4 对小鼠IgG含量的影响 抗体是体液免疫的最终产物，IgG是血清中的重要抗体，在体液免疫中起主要作用。本试验结果显示，与对照组相比，各试验组IgG含量均明显提高。

4.5 对小鼠抗应激能力的影响 国内外研究已证实，应激能影响动物的免疫机能。大量研究表明，应激后，吞噬细胞的吞噬率和吞噬指数明显降低，脾脏NK细胞活性和淋巴细胞对ConA刺激的增殖反应降低。这种应激引起的免疫抑制在一定时间可恢复，再次应激刺激仍可表现出抑制作用，尤其是对NK细胞活性的抑制；同时，应激对T、B淋巴细胞功能也存在抑制作用。本试验中，各试验组与对照组比较，小鼠的常压耐缺氧时间，游泳时间，耐高温时间均明显延长，这与各试验组对小鼠的免疫增强作用是一致的。路筱涛和鲍淑娟（2002）试验也证实，刺梨多糖能明显延长小鼠耐缺氧时间及游泳时间，还能提高小鼠耐高温、耐低温的能力，因此具有明显的抗应激作用。

迄今为止，己有300多种活性多糖从天然产物中被分离提取。但这些被分离提取出的多糖多为植物多糖，由于微生物多糖除具有与植物活性多糖类似的结构、组成成分及生物功能外，还具有生产周期短、生产不受季节与地理条件及病虫害限制、无毒及不污染环境等优点。把三种免疫效果较好的微生物多糖与黄芪多糖复配在一起，既节约成本，又获得具有多种活性的复合多糖，从而实现了多糖间的互补性和协同性。

[1]龚晓健，季晖，卢顺，等.人工虫草多糖对小鼠免疫功能的响[J].中国药科大学学报，2000，31（1）：53 ～ 55.

[2]路筱涛，鲍淑娟.刺梨多糖对小鼠抗应激功能和免疫功能的影响[J].广州中医药大学学报，2002，19（2）：141 ～ 142.

[3]刘正远，袁缨，刘国华，等.冬虫夏草、寡糖和微生态制剂对肉仔鸡生长性能和免疫功能的影响[J].沈阳农业大学学报，2006，37（1）：105 ～ 107.

[4]魏建忠，褚照龙，陈安徽，等.虫草饲料添加剂对土杂肉鸡增重效果研究[J].中国畜牧兽医，2005，32（10）：8 ～ 9.

[5]王志俊.对当归、淫羊藿和黄芪的提取方法的研究[J].海峡药学，2010，22（3）：82 ～ 83.

[6]吴小刚，吴周和，吴传茂.啤酒提取工艺条件的研究 [J].饲料工业，2006，27，9：27 ～ 29.

[7]杨铁虹，贾敏，梅其炳.当归多糖对小鼠免疫功能的调节作用[J].中成药，2005，27（5）：563 ～ 566.

[8]姚庆智，何秀玲，张智毓，等.蒙古口蘑及其多糖提取物对小鼠免疫功能的影响[J].动物医学进展，2011，32（2）：47 ～ 51.

[9]张青，张天民.苯酚一硫酸比色法测定多糖含量[J].山东食品科技，2004，7（1）：117.