单菌和混菌固态发酵三七渣生产蛋白饲料的动力学比较

成都信息工程学院资源环境学院 谭显东 段娅宁 王君君 羊依金

通过固态发酵技术将中药渣转变为蛋白饲料，可以实现中药渣的完全利用，所获得的饲料产品适口性好，营养丰富，并且具有防病保健的功效（刘凤梅等，2011；谭显东等，2010、2008；秦岭等，2008；王兵等，2007；杨威，2006）。

有研究认为，混菌发酵更具有优势，一方面，混菌发酵能够充分利用不同菌株基因产物，完成单个菌种难以完成的复杂代谢作用；另一方面，酶促作用生成的糖立即被发酵糖的微生物所利用，因此有利于维持降解产物较低的浓度，消除降解产物对酶合成的阻遏作用和反应终产物对酶的反馈抑制，缩短发酵过程（邱立友，2008；陈洪章和徐建，2004）。为了考察酵母菌的加入对康宁木霉发酵三七渣的影响，试验采用康宁木霉/热带假丝酵母对其进行混菌发酵，分析其发酵动力学过程，并将混菌发酵过程与单菌发酵过程进行比较。

1 材料与方法

1.1 菌种康宁木霉（Trichoderma koningii 3.2774）由四川大学建筑与环境学院提供；热带假丝酵母（Candida tropicalis）由河北科技大学生物科学与工程学院提供。

1.2 培养基 PDA培养基：马铃薯浸取液1.0 L，葡萄糖20.0 g，琼脂15.0 g，pH自然，121℃灭菌20 min，用于康宁木霉的培养；土豆汁培养基：土豆汁1.0 L，葡萄糖20.0 g，pH自然，121℃灭菌20 min，用于热带假丝酵母的培养。除特别说明外，本试验所用固态培养基组成为：过60目筛的三七渣 10.0 g， 固液比为 1∶2，（NH4）2SO40.5 g，KH2PO40.02 g，K2HPO40.025 g，MgSO40.005 g，NaCl 0.005 g。初始pH自然，121℃灭菌30 min，用于固态发酵试验。

1.3 三七渣 三七渣由四川省某中成药厂提统供，湿物料经烘干、粉碎、过60目筛后置于干燥器中备用。本试验所用药渣中主要成分含量如下：淀粉33.13%，粗蛋白质12.28%，真蛋白质9.97%，还原糖0.35%。本文中若无特别说明，药渣质量均以绝干物料计量。

1.4 种子液 康宁木霉采用PDA平板培养基在30℃下恒温培养3～3.5 d后刮下，将其制成浓度为2×107个/mL的孢子悬液；热带假丝酵母采用土豆汁培养基在30℃下恒温培养约16 h，制成浓度为2×107个/mL的菌悬液。接种量定义如下：10 g三七渣培养基中接入1 mL菌悬液 （或孢子悬液），称为10%的接种量，依此类推。

1.5 试验方法

1.5.1 固态发酵法 康宁木霉纯种发酵：取若干个容量为250 mL的锥形瓶，每个锥形瓶中装入含10 g三七渣的固态发酵培养基，将其高温灭菌冷却后接入1 mL康宁木霉孢子悬液，然后进行恒温培养：培养温度为30℃，培养时间为10 d。试验开始后每隔12 h按次序取出其中的部分锥形瓶用于分析测试发酵培养物的pH、淀粉酶活、干重、淀粉含量、粗蛋白质含量、真蛋白含量、还原糖含量、总糖含量。康宁木霉/热带假丝酵母混菌发酵：除了接种条件（先接入1 mL康宁木霉孢子悬液，恒温培养24 h后再接入1 mL的热带假丝酵母菌悬液）与康宁木霉纯种发酵过程有所区别外，其余过程均相同的；试验结果为3个平行样试验结果的平均值。

1.5.2 分析方法 粗蛋白质的测定：采用凯氏定氮法测定（张丽英，2010）；真蛋白质的测定：发酵样品先进行醇洗去除其中的无机氮 （胡艳丽和王克然，2007），再采用凯氏定氮法测定 （张丽英，2010）。还原糖、总糖的测定：采用3，5-二硝基水杨酸法（俞建瑛等，2005）；粗酶液的提取与酶活的测定：准确称取1.00 g发酵培养物（湿基），将其溶于pH为4.6的50 mL 0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲液中，在40℃恒温空气浴中振荡浸提1 h，然后经四层纱布过滤后，将滤液在5000 r/min条件下离心10 min，取上清液制成粗酶液，置于冰箱中待用。淀粉酶活力参照（陈毓荃2002）提供的方法进行测定；淀粉的测定：酸水解法（中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会，2009）。

2 结果与讨论

2.1 真蛋白质含量的动态变化 由图1可知，发酵过程中发酵培养物真蛋白质含量的变化大致可以分为三个阶段：第一个阶段：发酵0～24 h期间，真蛋白质含量几乎无变化；第二个阶段：发酵24～72 h期间，真蛋白质含量增长迅速；第三个阶段：发酵72～192 h期间，真蛋白质含量增长缓慢，特别是在168～192 h，真蛋白质含量基本无变化。在发酵0～144 h期间，混菌发酵体系与单菌发酵体系的真蛋白质含量基本相同；在发酵末期（156～192 h），单菌发酵体系的真蛋白质含量比混菌发酵体系要高出近两2百分点。

图1 发酵培养物真蛋白质含量的动态变化

2.2 产品收率的动态变化 由图2可知，随发酵时间的延长产品收率不断下降。在发酵0～108 h期间，产品收率下降较快；在发酵156～192 h期间，产品收率几乎不再变化，并且混菌发酵体系的产品收率比单菌发酵体系高出大约3个百分点。

2.3 还原糖和总糖含量的动态变化 由图3可知，发酵过程中总糖含量不断降低，还原糖含量先升高，到达峰值后又逐渐下降。混菌发酵体系还原糖含量先于单菌发酵体系达到峰值，并且混菌体系的峰值略高于单菌体系；在发酵12～84 h期间，混菌发酵体系的总糖含量低于单菌发酵系统，说明酵母菌的加入在发酵前期可以促进总糖的消耗，提高还原糖生成的速率。

2.4 pH的动态变化 由图4可知，单菌发酵系统和混菌发酵系统的pH下降趋势基本一致，但是在发酵36～72 h期间混菌发酵体系的pH明显低于单菌发酵体系，这与发酵前期酵母菌对总糖代谢的促进作用相关。

2.5 淀粉酶活力的动态变化 由图5可知，发酵初期（0～36 h），单菌和混菌发酵体系的淀粉酶活力均比较低，且差距不大；此后，单菌体系的酶活力均要高于混菌体系。原因可能是发酵初期，生物量相对较少，体系中的营养组分能够同时满足多种微生物生长的需要，但是到了发酵中后期，随着生物量的增加，混菌体系中酵母菌会与康宁木霉竞争有限的营养物质，从而在一定程度上影响康宁木霉的生长和产酶。

2.6 淀粉含量的动态变化 由图6可知，在发酵60 h以后，单菌发酵体系的淀粉含量一直低于混菌发酵体系；由此说明在发酵中后期，与混菌发酵体系相比，单菌发酵体系更能促进淀粉的水解和利用，这与发酵中后期酵母菌与康宁木霉竞争营养物质从而影响康宁木霉产酶相关。

3 结论

采用康宁木霉/热带假丝酵母混菌固态发酵三七渣生产蛋白饲料的动力学研究结果表明,与康宁木霉纯种发酵相比，康宁木霉/热带假丝酵母混菌固态发酵三七渣生产蛋白饲料无明显优势。在发酵前期，混菌发酵体系可以在一定程度上促进总糖消耗、提高还原糖生成的速率；在发酵中后期，单菌发酵体系的酶活力和真蛋白质含量更高。

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