阿维链霉菌原生质体制备方法的研究

张 毅

（湖北省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，湖北 武汉 430064）

1975年，日本北里研究所（Kitasato Insitute）从日本静冈县伊东市河奈（Kawana）地区一个土壤样品中分离得到一株链霉菌[1]。美国默克公司（Merck）的进一步实验和分类鉴定结果证明，它是链霉菌属的一个新种，定名为Streptomyces avermitllis，原始菌株编号为A-4680。后来该驱虫活性物被鉴定为是一族结构相似的16元环大环内脂类化合物，含有8个结构相似的组分，分别编号为 Ala，A2a，Alb，A2b，B1a，B2a，Blb 和 B2b[2]。尽管 Streptomyces avermitllis产生8个组分的阿维菌素，但只有B1组分的杀虫活性最高，毒性最小，被作为杀虫剂在农业和畜牧业中广泛使用。为了提高活性、扩大抗虫谱和降低毒性，研究人员对阿维菌素进行了诱变、生物转化和化学修饰等一系列的改造[3]。阿维菌素优良菌株的选育有着重要意义和实用价值。20世纪70年代以来，各种原生质体操作技术己成为工业微生物育种的重要手段，并取得了较大的成就。以微生物原生质体为材料的常见育种方法有原生质体再生育种、原生质体诱变育种、原生质体融合育种及基因组重排育种等。笔者围绕原生质体制备的方法，以工业阿维链霉菌为研究对象，进行了原生质体制备的研究，旨在为阿维菌素菌种选育提供理论支持和技术帮助。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株 阿维链霉菌工业生产菌株Z1，由武汉天惠生物研究所提供。

1.1.2 培养基 链霉菌孢子培养基（MS）：黄豆粉20 g，甘露醇 20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，115℃、25 min灭菌2次，每1 000 mL加入2.5 mol/L的MgCl24 mL。链霉菌菌丝培养基（YEME）：Difco酵母粉3 g，Difco蛋白胨5 g,Oxoid麦芽3 g，葡萄糖 10 g，蔗糖 103 g,蒸馏水 1 000 mL，115℃灭菌 25 min，临用前按2 ml/L补加2.5 mol/L MgCl2·6H2O，制备原生质体时按25 ml/L加入20%甘氨酸。

1.2 试验方法

1.2.1 原生质体制备 在装有不锈钢珠的250 mL三角瓶中加入25 mL YEME培养基。加入大约0.1 mL孢子悬液及所需生长因子后，在30℃旋转式摇床上培养36～40 h。将培养物倒入20 mL的旋盖小瓶中，3 000 r/min离心10 min收集菌丝体，弃去上清液。将菌丝体沉淀悬浮于15 mL 10.3%的蔗糖溶液中，3 000 r/min离心10 min。重复上一步骤，弃去上清液，将菌丝体悬于10 mL溶菌酶溶液（2 mg/mL，溶于P缓冲液）中，30℃保温15～60 min。用5 mL吸管吹吸3次，保温15 min。补加5 mL P缓冲液，用5 mL吸管再次吹吸。用装有脱脂棉的试管过滤，滤液转入塑料管中。3 000 r/min离心7 min，沉淀原生质体，弃去上清液，将原生质体悬浮于1 mL P缓冲液[4]中备用。

1.2.2 原生质体的计数方法 利用血球计数器在显微镜下直接计数。将原生质体制备液放在血球计数器的计数室中，放上载玻片，在高倍镜下进行计数。计数时，在每个中方格中数4个小方格（每个小方格控制在5～10个单位为宜），记录5个中方格（即20个小方格）的总菌数，重复计数2次，取平均值。计算公式：

单位体积的总菌数（1 mL）=2×105×A×B

式中A为20个小方格中的总菌数，B为悬液稀释度。

1.2.3 原生质体的再生 将已经制备好的原生质体悬浮液，分别以高渗P缓冲液以及无菌水稀释后，涂布于再生培养基平板上，置于28℃保温培养7～10 d，待长成菌落后分别计数。

1.2.4 原生质体融合和再生 采用PEG诱导融合法，用高渗P缓冲溶液稀释2株亲本菌株原生质体悬浮液，等量混合，混匀之后，3 000 r/min离心15 min，弃去上清液。加少量高渗P缓冲溶液将原生质体沉淀悬浮，再加入含0.05 mol/L CaCl2，0.02 mo1/L MgCl2和50%PEG 1 000的高渗P缓冲液2.5 mL，轻微振荡混匀，25℃保温5 min后，加高渗P缓冲溶液2.5 mL，洗涤、离心，重复洗涤1次。融合的原生质体经梯度稀释后接种于再生培养基上，28℃保温培养7～10 d，待长成菌落后分别计数。

融合率=原生质体融合后再生的菌落数/未经灭活的原生质体再生菌落数×100%

1.3 试验设计

1.3.1 菌丝体培养时间对原生质体形成的影响 分别采用培养 16、24、32、40、48 h 的菌丝体来制备原生质体，研究其培养时间对原生质体形成的影响。

1.3.2 甘氨酸对原生质体形成的影响 在阿维菌素菌丝培养基中加入甘氨酸的浓度分别达1、2、3、4、5 mg/mL时，研究甘氨酸对原生质体形成的影响。

1.3.3 溶菌酶浓度对原生质体形成的影响 加入溶菌酶浓度达 2、3、4、5 mg/mL 时，28℃酶解 45 min，研究溶菌酶浓度对原生质体形成的影响。

1.3.4 酶解温度对原生质体形成的影响 在溶菌酶浓度为4 mg/mL，酶解50 min的条件下，分别以26、28、30、32℃不同酶解温度对菌丝体进行处理，测定原生质体形成数和再生率。

1.3.5 酶解时间对原生质体形成的影响 在溶菌酶浓度为4 mg/mL，酶解温度为30℃的条件下，对菌丝体处理 35、40、45、50、55、60 min 不同的酶解时间，测定原生质体形成数和再生率。

2 结果与分析

2.1 菌丝体培养时间对原生质体形成的影响

分别采用培养 16、24、32、40、48 h 的菌丝来制备原生质体，培养时间40 h，形成原生质体数分别为 0.79×107、4.30×107、5.70×107、6.90×107、6.10×107个/mL。菌丝培养时间太长容易产生黑色素。

2.2 甘氨酸对原生质体形成的影响

在阿维菌素菌丝培养基中分别加入1、2、3、4、5 mg/mL的甘氨酸后，原生质体释放量分别为4.1×107、4.9×107、5.8×107、7.2×107、6.0×107个/mL。由试验结果可知，当加入4 mg/mL甘氨酸时，原生质体释放量最大。

2.3 溶菌酶浓度对原生质体形成的影响

溶菌酶的浓度应该适当，过高或过低都不利于原生质体的形成和再生。如表1所示，当加入溶菌酶4 mg/mL时，原生质体形成数最大，为5.84×107个/mL，再生率达27.2%，原生质体制备和再生能得到较好的效果。

表1 溶菌酶浓度对原生质释放的影响

2.4 酶解温度对原生质体形成的影响

不同的酶具有不同的最适温度，温度过高或者过低不但对酶的活性有影响，也会导致原生质体活性降低。由表2可知，酶解温度为30℃，原生质体形成数最大，为 6.23×107个/mL，再生率达 29.3%，原生质体制备和再生能得到较好的效果。

表2 不同酶解温度对原生质释放的影响

2.5 酶解时间对原生质体形成的影响

酶解时间会影响原生质体的制备和再生。由表3可知，在酶浓度为4 mg/mL，酶解温度为30℃的条件下，随着酶解时间的延长，原生质体的形成量也相应增加。当酶解时间为50 min时，原生质体形成数和再生率都达到一个较佳结果，因此试验选用酶解时间为50 min。

表3 不同酶解时间对原生质释放的影响

2.6 PEG相对分子量及浓度对融合率的影响

原生质体融合是生物体相互结合的复杂过程，其融合效率受到融合剂种类、融合剂分子量等许多因素的影响。当PEG相对分子量分别为800、1 000、2 000、4 000、6 000 ，浓度为 40%时，链霉菌原生质体融合率分别10.1%、13.8%、12.9%、12.6%、13.3%。不添加PEG的融合率为0，PEG 1 000做融合剂时融合效率最高。融合率与PEG浓度也有很大的关系。高浓度的PEG不仅引起原生质体皱缩，而且有毒性，影响原生质融合体的再生。当PEG 1 000的浓度分别为0、20%、30%、40%、50%、60%时，原生质体融合率分别为 0、12.6%、14.1%、13.8%、15.5%、13.0%。当PEG 1 000浓度为50%时，融合率最高，因此试验采用的PEG浓度为50%。

3 结论

阿维菌素（avermectins）是由阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）发酵产生的是一组高效、低毒、广谱的杀虫抗生素，在医药、农业和畜牧业生产中有良好的应用，并且具有广阔的市场前景。研究结果表明，工业阿维链霉菌Z1原生质体制备再生的最佳条件为：在250 mL三角瓶装35 mL含0.5%甘氨酸的YEME培养基中，孢子悬液接种，28℃、200 r/min培养 40 h；3 000 r/min收集菌丝体，并用浓度为10.3%蔗糖溶液清洗2次；在溶菌酶浓度为4 mg/mL的P缓冲液悬浮菌丝体，30℃下酶解50 min，原生质体制备完成。原生质体在PEG 1 000浓度为50%时，融合率最高。

[1]Omura S,Ikeda H,Ishikawa J,et al.Geome sequence of an industrial microorganism Streptomyces avermitilis:deducing the ability of producing secondary metabolites[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98:12215-12220.

[2]Ikeda H,Ishiawa J,Hanamoto A,et al.Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis[J].Nat Biotechnol.2003,21:526-531.

[3]朱蓓蕾，李俊锁.阿维菌素类药物的研究进展[J].畜牧兽医学报，2000，31（6）：520-529.

[4]张 毅.阿维菌素高产菌株的选育 [D].武汉：华中农业大学，2008.