DLL4和Notch4在膀胱尿路上皮癌中的表达及临床意义

陈 虹 张 声 陈余朋

（福建医科大学附属第一医院病理科，福州 350005）

膀胱尿路上皮癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，发病率和复发率非常高，而血管生成是膀胱癌生长转移的基础。如能有效抑制血管新生，切断肿瘤血供，有望达到抑制肿瘤生长、发展及转移的目的。多年研究表明VEGF信号通路是血管形成发育早期阶段必需的中心环节。该发现推动了VEGF抑制剂的临床应用，但更多的临床靶基因试验显示存在VEGF抑制剂耐药的病例，因此促使人们寻找肿瘤血管生成通路中的其它基因。Delta－Notch是一个决定细胞命运的信号系统，尤其是DLL4和Notch4作为血管内皮细胞特异性配体和受体，在血管的新生、发育和成熟过程中起重要作用。因此DLL4/Notch4成为目前抗肿瘤血管治疗最受关注的新靶点。但DLL4/Notch4和膀胱尿路上皮癌的相关性研究甚少。本研究采用组织芯片免疫组织化学方法观察DLL4和Notch4在膀胱尿路上皮癌和癌旁组织的表达，分析其与临床病理特征的相关性，借以探讨DLL4和Notch4与膀胱尿路上皮癌发生发展的关系。

材料和方法

1.一般资料

依据随机原则，搜集2008年1月至2010年12月福建医科大学附属第一医院存档的石蜡包埋膀胱癌组织85例，男性75例，女性10例，年龄31－83岁，中位年龄65岁，所有病例均有完整的临床病理资料及随访资料。另27例癌旁组织距瘤缘3－5cm。所有病例均由2名有经验的病理医师按照WHO分类标准进行诊断，临床分期按照国际抗癌联盟（UICC）TNM分期进行［1］。标本经 HE染色，光镜观察诊断：浸润性尿路上皮癌40例，其中高级别23例，低级别17例；非浸润性乳头状尿路上皮癌45例，其中高级别4例，低级别41例。临床分期：Ta 45例，T123例，T29例，T35例，T43例。其中未经化疗的初发肿瘤62例，化疗后复发肿瘤23例。

2.组织芯片制备

根据H.E染色切片在供体组织蜡块上选取目标区域并标记（尿路上皮癌85例，癌旁组织27例），每例膀胱组织取3个位点，将相应组织由供体蜡块转移至受体蜡块的阵列孔中，每个孔芯的直径约2 mm，每个蜡块含有49个点，最后一个为标志点。

3.主要试剂及方法

兔抗人 Notch4多克隆抗体（sc－5594，1：100稀释，Santa Cruz公司）；兔抗人DLL4多克隆抗体（HPA023392，1：50稀释，Sigma公司）。免疫组化操作步骤如下：将组织芯片蜡块4μm连续切片，60℃烤片14h，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水后水化。高压热修复（柠檬酸pH 6.0，2min），自然冷却；3%过氧化物酶阻断10min，强力阻断剂室温孵育10 min，不冲洗；一抗室温孵育2h；Super Enhancer室温孵育20min；Polymer－HPR孵育30min；DAB显色镜下控制；每个步骤之间PBS冲洗3次，每次3 min。苏木素复染。以PBS代替一抗作阴性对照。

4.免疫组化结果判读

Notch4和DLL4阳性表达为细胞浆的棕黄色颗粒：Notch4位于膀胱尿路上皮细胞浆，而DLL4主要位于血管内皮细胞浆。每张切片随机观察10个高倍视野，评价其阳性细胞率和着色强度，将切片中细胞浆着色强度评分（无，0分；弱，1分；中，2分；强，3分）和切片中阳性细胞率评分（＜5%，0分；6%－10%，1分；11%－20%，2分；21%－50%，3分；＞50%，4分）之和为该病例评分值，将评分值≤2分定为阴性病例，≥3分定为阳性病例。

5.统计学处理

所得数据应用SPSS13.0进行分析，采用χ2检验或Fisher精确概率法分析Notch4和DLL4表达及其与临床病理特征的关系，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.组织芯片的HE染色

HE染色显示组织芯片样本排列整齐，组织结构完整；尿路上皮癌细胞层次增多，排列极性紊乱，细胞核大、深染，可见核分裂象，部分可见异型性明显的瘤巨细胞（图1）；癌旁膀胱黏膜细胞排列整齐，层次清晰，伞细胞层存在（图2）。

2.免疫组化Notch4和DLL4的表达

Notch4在尿路上皮癌胞浆中呈棕褐色颗粒强阳性表达（图3），癌旁组织的膀胱黏膜上皮呈棕黄色颗粒，表达较弱；尿路上皮癌中Notch4阳性表达率为89.4%，在癌旁正常膀胱黏膜阳性表达率为66.7%。两者差异有显著性（P＜0.05），具体见表1。

表1 尿路上皮癌和癌旁黏膜Notch4表达Table1 Notch4in bladder urothelial cancer and cancer side tissue

DLL4主要在血管内皮细胞胞浆表达呈棕黄色颗粒，少量表达于尿路上皮癌的胞浆和胞膜（图4）。尿路上皮癌中DLL4阳性表达率为54.1% ，癌旁正常膀胱黏膜阳性表达率为29.6% 。尿路上皮癌中DLL4阳性表达率高于癌旁正常膀胱黏膜，两者差异有显著性（P＜0.05），具体见表2。

Notch4和DLL4在膀胱尿路上皮癌中的表达与临床病理特征的关系（表3），显示：Notch4和DLL4在T2－4期膀胱尿路上皮癌中表达高于Ta－1期肿瘤，高级别的膀胱尿路上皮癌表达高于低级别肿瘤，但差异无统计学意义（P＞0.05）。Notch4和DLL4在膀胱尿路上皮癌中的表达与患者性别、年龄、临床分期、病理分级及初复发均无显著相关性（P＞0.05）。

表2 尿路上皮癌和癌旁黏膜DLL4表达Table2 DLL4in bladder urothelial cancer and cancer side tissue

表3 Notch4和DLL4表达与膀胱尿路上皮癌临床病理特征的关系Table3 The expression of Notch4and DLL4with the correlation of clinical and pathological feature in bladder urothelial cancer

讨 论

Notch信号途径是保守进化的由多种分子参与的复杂信号传导通路，是相邻细胞之间通讯进而调控细胞发育的典型例子。DLL4是Notch信号途径中的一个重要配体，与其邻近细胞的相应受体（Notch1和Notch4）结合，启动细胞内的信号传递，调节血管的生成和分支过程。DLL4－Notch信号系统同样能干预肿瘤性血管的生成和发育。多个研究小组采用不同方法阻断DLL4－Notch信号途径，均有效抑制了肿瘤组织的生长。Patel［2］等应用RNA干扰技术抑制内皮细胞表达DLL4，导致 HEY1和EphrinB表达下调，继而抑制内皮细胞的增殖、迁移和血管网形成等这些肿瘤性血管生成的重要过程。Hainaud［3］等利用增加DLL4胞外可溶性片段竞争的方法来抑制DLL4的活性，结果发现肿瘤中异常的血管重建显著减少。此外，Noguera－Troise［4］等在荷瘤小鼠的研究中发现：增加DLL4－Notch的活性导致肿瘤血管密度降低，原因是肿瘤血管出芽和血管网分支减少；相反，阻断DLL4－Notch肿瘤血管密度显著增加，组织学观察发现血管出芽并含有大量吻合支，但功能学的研究发现新生的血管血流灌注差并且缺氧严重，且与对照组相比，肿瘤的体积缩小，继续阻断DLL4－Notch，肿瘤变得更小，缺氧更严重，无功能性血管更明显。Scehnet［5］等同样也发现抑制DLL4可诱导未成熟血管增殖，从而使组织血流灌注更差，移植瘤生长受抑。另外，DLL4－Notch信号途径在抑制肿瘤的生长方面具有血管专一性。Ridgway［6］等使用DLL4特异性抗体处理，实现了肿瘤生长的有效抑制，并且这种抑制只发生在血管新生阶段，而对维持正常血管作用不大；更为可喜的是，这种抑制选择性影响脉管系统，却不影响小肠的杯状细胞，这个发现为肿瘤治疗提供更加有利的选择。DLL4－Notch信号途径一方面通过抑制新生血管的过度增殖来减少其形成的数量，另一方面则通过促进新生血管的发育和成熟来改善肿瘤新生血管的功能，但其中的具体作用机制尚未完全清楚［7－9］。

已知DLL4和Notch4在多种人类肿瘤血管组织中过度表达，如乳腺癌、结直肠癌、骨肉瘤、脑胶质母细胞瘤等［10－13］。DLL4－Notch信号通路作为新的抗血管生成的治疗靶点，在抑制乳腺癌、纤维肉瘤等实体瘤生长已取得显著效果，而在膀胱尿路上皮癌中的研究才刚刚开始。Patel等发现膀胱非浸润性尿路上皮癌组织中DLL4的表达量是正常膀胱组织的2倍，浸润性尿路上皮癌DLL4表达量是正常组织的1.5倍，且DLL4的表达水平与膀胱癌预后相关［14］。本研究结果显示：DLL4和Notch4两者在膀胱尿路上皮癌中的表达明显高于癌旁正常黏膜，说明DLL4和Notch4可能与膀胱尿路上皮癌的发生相关。本研究还发现临床分期和病理分级高的膀胱尿路上皮癌中Notch4和DLL4的表达均较高，但差异无显著性，因此，DLL4和Notch4与膀胱尿路上皮癌的进展是否相关，需要扩大样本量来进行更深入的研究。

总之，DLL4是由VEGF诱导，并且能负反馈调节血管的出芽和分支，甚至对抗－VEGF治疗抑制的肿瘤，阻断DLL4也能有效抑制肿瘤的生长，相信随着DLL4－Notch与膀胱尿路上皮癌关系的研究不断深入，联合应用VEGF和DLL4抑制剂应该会成为膀胱尿路上皮癌抗血管治疗新的途径。

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