阿魏酸钠干预对Rho／Rock信号通路的影响及其对肝脏的保护作用

李 凤，高海成，盛晓彤，孙文艺，陈园园，杨秀娜，陈金彤，蒋 博，国中华，孙 波

（1.吉林大学第二医院妇产科，吉林 长春 130041；2.吉林大学药学院临床药学，吉林 长春 130021；3.吉林省通化四环有限公司，吉林 通化 134000）

阿魏酸钠干预对Rho／Rock信号通路的影响及其对肝脏的保护作用

李 凤1，高海成2，盛晓彤2，孙文艺2，陈园园2，杨秀娜2，陈金彤2，蒋 博2，国中华3，孙 波2

（1.吉林大学第二医院妇产科，吉林 长春 130041；2.吉林大学药学院临床药学，吉林 长春 130021；3.吉林省通化四环有限公司，吉林 通化 134000）

目的：探讨阿魏酸钠（SF）干预后对Rho／Rock信号通路相关蛋白表达及肝脏的影响，阐明其对脏器的保护作用。方法：雄性Wistar大鼠20只，分为正常对照组、模型组、阳性药组及SF干预组。除正常对照组外，其余组大鼠注射盐酸异丙肾上腺素（Iso）15mg·kg－1诱发大鼠心肌纤维化模型；稳定2d后，除模型组外，其余2组给予SF和贝那普利。利用Masson染色分析给予SF后心肌胶原的含量变化；RT－PCR法分析Rho A和Rock mRNA表达；采用免疫组织化学染色分析心肌Rock蛋白表达；拉曼光谱分析肝脏的损伤。结果：与正常对照组比较，注射Iso后3周，Rho A和Rock mRNA表达即有所增加 （P＜0.01）；给予SF和贝那普利后，Rho A和Rock基因和蛋白表达水平较模型组明显降低（P＜0.01）；拉曼光谱分析结果显示，给予SF后大鼠肝脏组织的峰位较模型组向右移动1个单位，趋近正常对照组峰位。结论：SF可能通过阻断Rho／Rock信号通路进而起到抑制纤维化的作用，同时又起到肝脏保护作用。

心肌纤维化；阿魏酸钠；Rho／Rock通路

随着人口的老龄化，心血管类疾病已变为严重威胁人类健康的重要疾病。然而多种心血管疾病，如心肌梗死、慢性充血性心力衰竭、高血压心脏病、糖尿病性心肌病变、心肌病以及心肌炎等等，均伴有心肌重构的过程，而心肌纤维化（myocardial fibrosis，MF）是心肌重构的重要环节［1－2］。在临床上具有重要的意义，已成为当前的研究热点。Rho／Rock信号通路介导多种功能异常的疾病，是近年的研究热点之一［3］，其通过调节细胞内微丝骨架的聚合状态，参与多种疾病的生物学过程，如动脉粥样硬化、MF等［4］。阿魏酸钠（sodium ferulate，SF）是阿魏酸钠盐，具有扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环、抑制炎症反应和抗氧化等药理学作用，目前研究最多的是其抗氧化和内皮素受体拮抗作用［5－7］。然而，有关SF对心肌的保护作用及其对Rho／Rock信号通路的影响，迄今国内外尚未见报道。本研究将为临床防治MF具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 盐酸异丙肾上腺素（Iso）由上海禾丰制药有限公司生产；小鼠抗大鼠RockⅠ单克隆抗体及SP－9000免疫细胞化学试剂盒，由北京中衫金桥生物技术有限公司提供；徕卡4215切片机（德国徕卡仪器有限公司）；Olympus PM－10AO全自动显微照相装置（日本，日本岛津公司）。

1.2 实验动物及分组 雄性 Wistar大鼠20只，体质量180～220g，由吉林大学实验动物中心提供［动物合格证号：SYXK（吉）2007－0012］。随机分为正常对照组、Iso组（3周组）、贝那普利阳性对照组（Bena组）和阿魏酸钠组（SF组），每组5只。Iso组大鼠采用多点皮下一次性注射15mg·kg－1的Iso诱发MF；正常对照组注射15mg·kg－1的生理盐水。自造模稳定2d后，SF组除注射Iso外，腹腔注射110mg·kg－1SF，每日1次；Bena组大鼠除注射Iso外，15mg·kg－1Bena混悬液灌胃，每日1次。3周后，脱臼处死大鼠。

1.3 病理标本的获取 处死大鼠，经10%甲醛固定30min；常规石蜡包埋。用二甲苯脱蜡10min，用100%～75%乙醇置换二甲苯。经苏木素染色，盐酸乙醇分化，伊红染色。

1.4 Rock免疫组织化学染色 石蜡切片，常规脱蜡至水。3%H2O2去离子水（无色液体）孵育5～10min。滴加试剂A液室温孵育10～15min，倾去，勿洗。滴加适当比例稀释的一抗，4℃过夜。PBS冲洗，3min×3次。滴加试剂B液，室温或37℃孵育10～15min。PBS冲洗，3min×3次。滴加试剂C液，室温孵育10～15min。PBS冲洗，3min×3次。DAB显色，复染，脱水，透明，封片。1.5 免疫组织化学图像分析 于每张切片左心室尖部，随机选取5个高倍镜视野（×400），用病理图像分析系统对所选视野内的阳性信号进行图像分析，计算阳性信号的平均吸光度（A）值。

1.6 半定量RT－PCR 取新鲜冻存心脏组织，按Trizol试剂盒提供方法提取总RNA。采用逆转录法进行扩增。GAPDH内参基因上游引物：5′－ACCACAGTCCATGCCATCAC－3′，下 游 引 物：5′－TCCACCACCCTGTTGCTGTA－3′；Rock上游引物：5′－GGTGATGGCTATTATGGACG－3′，下游引物：5′－GTGTCTCGGAGCGTTTCC－3′；Rho A上 游 引 物：5′－GATGGAGCTTGTGGTAAGA－3′，下 游 引 物：5′－AAACTATCAGGGCTGTCG－3′。退火温度55℃，循环35次，扩增产物长度分别为452、302和239bp。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，以GAPDH光密度作为参考定量标准，Rock和Rho A mRNA表达量以Rock和Rho A与GAPDH A值之比表示。

1.7 拉曼光谱法测定肝脏组织的吸收 利用生理盐水匀浆各组肝脏组织，去除上清，剩余固体样本进行测定，测定范围为1 200～1 800cm2。

1.8 统计学分析 采用SPSS 11.0统计软件对数据进行分析处理，Rock和Rho A的基因和蛋白表达量以±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析。

2 结 果

2.1 Masson染色结果 正常对照组大鼠心肌间质仅见少量胶原，其整个视野的含量是17.1±2.4；而模型组在3周时胶原含量明显增加（48.6±4.5），其胶原含量明显高于正常组（P＜0.01）；给予SF和Bena后，其胶原含量（34.5±3.1，24.2±1.6）较模型组明显降低（P＜0.01）（图1）。

图1 各组大鼠心肌组织中胶原含量的变化（Masson染色，×400）Fig.1 The changes of collagen content in rat myocardium tissues in various groups（Masson staining，×400）

2.2 各组大鼠心肌组织中Rock蛋白的表达量

正常对照组大鼠心肌间质可见极少量、呈黄褐色的微弱阳性表达，在成纤维细胞、血管内皮细胞的胞浆内表达，Rock的表达量是5.8±1.7。注射3周后，模型组大鼠心肌组织中Rock阳性表达量（25.9±2.0）较正常对照组增加 （P＜0.01）。而在Bena组与SF治疗组中Rock阳性表达量（18.5±1.4，19.9±1.5）较 模 型 组 明 显 降 低（P＜0.01）（图2）。

图2 各组大鼠心肌组织中Rock蛋白的表达（RockⅠ染色，×400）Fig.2 Expressions of Rock protein in rat myocardium tissues in various groups（RockⅠstaining，×400）

2.3 各组大鼠心肌组织中Rho A和Rock mRNA表达量 正常对照组的基因表达较少，其灰度值分别是 （Rho A）0.13±0.01和 （Rock I）0.31±0.03；注射Iso后3周，Rho A和Rock mRNA表达较正常对照组明显增加，其含量分别为0.48±0.05和0.62±0.02 （P＜0.01）；而Bena和SF组Rho A和Rock mRNA表达较模型组降低，其灰度值是 （Bena）0.39±0.08、0.47±0.03和 （SF）0.21±0.01、0.42±0.02（P＜0.01）。见图3。

图3 各组大鼠心肌组织中Rho A和Rock mRNA的表达Fig.3 Expressions of Rho A and Rock mRNA in myocardium tissue in various groups

2.4 阿魏酸钠对大鼠肝脏的影响 正常大鼠肝脏组织在1 447～1 594cm3有较明显的吸收峰位，其峰值是1 447cm3；而注射Iso诱发MF后的肝脏组织其峰值向左移动2个单位即1 449cm3；给予阿魏酸钠和贝那普利后拉曼光谱值相对于模型组即向右有所回落。见图4。

图4 肝组织的拉曼吸收光谱Fig.4 Raman spectrum of liver tissue

3 讨 论

SF是从当归、川芎类植物中获得的有效成分，有扩张血管、抑制血小板聚集、改善微循环、抑制炎症反应和抗氧化等作用，是作为治疗冠心病的理想药物之一［8－11］。目前，研究最多的是其抗氧化作用和内皮素受体拮抗作用，其可通过干预内皮素和氧自由基等机制保护脏器［7］。然而，有关SF是否通过阻断Rho／Rock通路进而对心肌纤维化起到治疗作用以及其对其他脏器的保护作用，迄今国内外鲜有报道。

本实验应用免疫组织化学法、RT－PCR及拉曼光谱等方法，系统研究了SF干预下Rho／Rock通路相关蛋白的表达及肝脏的影响，进而观察SF干预大鼠MF后对脏器的影响。

Rho／Rock信号通路的关键信号分子包括Rho GTP酶、Rock和肌球蛋白磷酸酶。Rho是Ras超家族中的小GTP蛋白，与基质细胞间黏附及细胞收缩等有关。Rho接受上游信号刺激后，从无活性的GDP结合形式转变成GTP结合的活性形式。而Rock是Rho下游的主要靶分子，接受Rho传递的活化信号后，通过多个氨基酸位点的磷酸化而激活，可介导其下游的磷酸化／脱磷酸化反应，可控制细胞的多种生物学行为［12］。Rho／Rock信号通路可在纤维化动物模型体内异常表达和活化；而在该通路抑制剂的干预下，可不同程度阻止和改善相应脏器的纤维化程度。因此认为Rho／Rock通路参与了纤维化的发生［13］。在本实验中，模型组Rho A及Rock的蛋白和基因表达均明显增加；而给予贝那普利和SF后，RhoA和Rock的基因和蛋白表达均有所降低；同时拉曼光谱结果亦显示：SF有保护肝脏的作用。因此，本文作者推测SF可改善MF大鼠的生存率，延缓和减轻 MF，抑制Rho／Rock通路进而起到抗纤维化的作用，同时亦可降低肝脏的损伤，其机制有待进一步研究。

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Effect of sodium ferulate on Rho／Rock signal pathway and its protective effect on liver tissue

LI Feng1，GAO Hai－cheng2，SHENG Xiao－tong2，SUN Wen－yi2，CHEN Yuan－yuan2，YANG Xiu－na2，CHEN Jin－tong2，JIANG Bo2，GUO Zhong－hua3，SUN Bo2
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，Second Hospital，Jilin University，Changchun 130041，China；2.Department of Experimental Pharmacology and Toxicology，School of Pharmacy，Jilin University，Changchun 130021，China；3.Victoria Limited Company，Tonghua City，Tonghua 134000，China）

Objective To investigate the effect of the expression of sodium ferulate（SF）on the related protein of Rho／Rock signal pathway and to clarify the protective effects on liver tissue and myocardium tissue.Methods Twenty male Wistar rats were divided into normal control group，model group，positive medicine group，and sodium ferulic group.Besides normal control group，the rats in the other groups were injected with 15mg·kg－1Iso to induce rat myocardial fibrosis.2dlater，except control and model groups，the rats in the other groups were given SF and Bena zepril.The change of collagen content in myocardium was analyzed by Masson staining.The expressions of Rho A and Rock mRNA were analyzed by RT－PCR.The expression of Rock protein was analyzed by immunohistochemistry.The Raman spectrum was used to detect the liver tissue injury.Results Compared with control group，the expressions of RhoA and Rock mRNA were increased after injection with Iso for 3weeks（P＜0.01）；compared with model group，the expressions of Rho A and Rock mRNA and protein were decreased after injection with SF（P＜0.01）.The Raman spectrum results showed that the peak value in SF group shifted to the right with one unit compared with model group，and tended to normal control group.Conclusion SF can not only protect the heart against fibrosis by inhibiting Rho／Rock pathway，but also can protect liver damage.

myocardial fibrosis；sodium ferulate；Rho／Rock pathway

R965

A

1671－587Ⅹ（2012）05－0889－05

2012－07－06

吉林省科技厅科研基金资助课题 （201101067）；广东省广州市天普项目基金资助课题 （2012099）；吉林大学基本业务费资助课题 （2012）

李 凤 （1965－），女，吉林省白城市人，主管技师，医学学士，主要从事妇产科及心血管学的研究。

孙 波 （Tel：0431－85619702，E－mail：sunbo＠jlu.edu.cn）

时间：2012－08－31 10：55

网络出版地址：http：／／www.cnki.net／kcms／detail／22.1342.R.20120831.1055.004.html