PDCD4在非小细胞肺癌中的表达及临床意义

刘启明

(江苏省睢宁县人民医院呼吸内科 江苏 睢宁 221200)

程序性细胞死亡因子4(PDCD4)是1995年Shibahara等在小鼠体内发现的与细胞凋亡有关的基因，不仅对细胞的程序性死亡进行重要调节，而且通过抑制蛋白转录和翻译过程抑制肿瘤细胞的生长。PDCD4与多种肿瘤的发生与发展有关，Jansen AP等[1]检测了60种来自肾脏、肺脏、结肠、乳腺以及神经胶质细胞的肿瘤细胞系中PDCD4的表达情况，结果显示，PDCD4在mRNA水平和蛋白水平上均有表达降低或缺失。有研究资料[2]显示，在肺癌组织中PDCD4缺失率高达83%，而且与肿瘤的恶性程度、TNM分期以及预后不良密切相关。本实验采用免疫组织化学技术检测NSCLC组织中PDCD4蛋白表达情况，并探讨蛋白的表达与患者临床特征的关系。为探讨PDCD4在NSCLC中的发病机制、病理诊断、预后价值以及选择治疗的靶点提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择潍坊市人民医院胸外科2006年8月～2010年3月手术切除的NSCLC标本54例，其中男33例，女21例;＜60岁的28例;≥60岁26例;有长期吸烟史22例，无吸烟史32例;鳞癌25例，腺癌29例;高分化11例，中分化31例，低分化12例;Ⅰ期 22例，Ⅱ期10例，Ⅲ ～Ⅳ期22例(依据2002UICC肺癌TNM分期标准)。并分别取癌旁组织(远离癌灶5CM以上)24例。所有组织标本使用中性甲醛固定，石蜡包埋备用。

1.2 方法

1.2.1 主要仪器及来源。YB－6LF智能型生物组织包埋机(湖北省孝感市亚光医用电子技术有限公司)、PHY－Ⅱ病理组织凉烘仪(常州市中威电子仪器公司)、BX41光学显微镜(日本OLYMPUS公司)、BX－51型生物光学显微镜及照相系统(日本OLYMPUS公司)。

1.2.2 药品与试剂。鼠抗人PDCD4一抗(北京博奥森生物工程有限公司)、鼠抗人DNMT1一抗(北京博奥森生物工程有限公司)、sABC免疫组织化学染色试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司)、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2.3 实验用溶液配制。①中性甲醛固定液配制:甲醛10mL、0.01MPBS 90mL。②苏木素染液的配制:苏木素1.0g、无水乙醇10mL、硫酸铝钾 20g、蒸馏水 200mL、氧化汞 0.5g。

1.2.4 试验方法。将手术标本使用中性甲醛固定，石蜡包埋，然后切成5μm厚的连续石蜡切片。两种染色方法的具体步骤分别如下。

1.2.4.1 HE染色。①切片常规脱蜡入水;②苏木素染色，自来水冲洗;1%盐酸酒精分色，自来水冲洗;伊红染色，自来水冲洗;梯度酒精脱水、二甲苯透明;③中性树胶封片。

1.2.4.2 免疫组织化学染色。①石蜡切片置于60℃烤箱中烤片2h，常规脱蜡入水;②置于枸橼酸缓冲液中微波炉抗原修复;③0.01PBS冲洗3min×3次;④3%过氧化氢37℃温箱孵育10min;⑤0.01PBS冲洗3min×3次;⑥滴加PDCD4，并用PBS取代一抗做空白对照，4℃冰箱过夜;⑦0.01PBS冲洗3min×3次;⑧滴加试剂1，37℃温箱孵育20min;⑨0.01PBS冲洗3min×3次;⑩滴加试剂 2，37℃温箱孵育 20min;⑪0.01PBS 冲洗 3min ×3次;⑫DAB室温显色2min，蒸馏水冲洗终止反应;⑬苏木素轻度复染细胞核，自来水冲洗;⑭梯度酒精脱水、二甲苯透明;⑮中性树胶封片，显微镜下观察免疫反应阳性结构的着色及分布情况。

1.3 实验结果判定 用PBS代替一抗作阴性对照，以已知阳性片作为阳性对照。细胞质内出现淡黄色至棕褐色颗粒为阳性染色。参考Monica等的半定量计数方法，根据肿瘤细胞的染色率进行判定。在400倍镜下选取5个视野，计数至少100个肿瘤细胞中PDCD4蛋白阳性表达细胞所占百分率。细胞阳性率＜5%为0分，5% ～25%为1分，26% ～50%为2分，51% ～75%为3分，＞75%为4分;最终得分取5个视野的平均值。规定0～4分为阴性，5～8分为阳性表达，9～12分为高表达。

1.4 统计学处理 应用SPSS 16.0软件，P值取双侧，P＜0.05为具有统计学意义。PDCD4在NSCLC、癌旁组织中的表达及与NSCLC患者的临床病理特征的关系采用χ2检验。

2 结果

2.1 PDCD4在 NSCLC组织、癌旁组织中的表达 PDCD4在NSCLC、癌旁组织中的表达阳性率分别为33.3%、75.0%，癌及癌旁组织表达之间的差异具有统计学意义(P＜0.01)，见表1。癌较癌旁组织出现低表达和缺失(见图1～4)。

表1 PDCD4在肺癌组织、癌旁及正常组织中的表达(例)

图1 鳞癌PDCD4的低表达(×400)

图2 正常组织PDCD4的表达(×400)

图3 腺癌PDCD4的表达缺失(×400)

图4 腺癌DNMT1的高表达(×400)

2.2 PDCD4在NSCLC组织中的表达与TNM分期的关系情况见表2。

2.3 PDCD4的表达与NSCLC组织分化轻度的关系 PDCD4的表达与NSCLC组织分化程度有关，差异有统计学意义(P＜0.05)，低、中分化较高分化表达下降。见表3。

2.4 PDCD4的表达与NSCLC患者的性别、年龄、吸烟史、病理类型等临床特征的关系 除PDCD4表达在吸烟和不吸烟的患者之间差异有统计学意义外，其余差别均无统计学意义(P＞0.05)。见表 4。

表2 PDCD4在肺癌组织中表达与TNM分期的关系(例)

表3 PDCD4表达与NSCLC组织分化程度的关系(例)

表4 PDCD4表达与NSCLC临床病理特征的关系(例)

3 讨论

PDCD4是新发现的与细胞凋亡有关的基因，通过一个保守的a螺旋MA－3结构与真核细胞翻译起始因子eIF4A发生结合，从而抑制核糖体复合物的形成和蛋白质的合成，促进细胞凋亡。PDCD4在人类组织中，例如:肝、肺、脑、食道等组织中都有表达。在大多数正常组织细胞中，PDCD4蛋白主要位于细胞核中，当细胞发生恶性增殖时，它可以通过NES转移到细胞浆中[3]。

在人类的多种恶性肿瘤如乳腺癌、肺癌、消化道肿瘤、脑胶质瘤、卵巢癌、皮肤癌、淋巴瘤、鼻咽癌等肿瘤组织中均发现PDCD4表达下降或缺失。Goke R等[4]研究证实了PDCD4作为CDK1/cdc2的间接抑制因子，在肺癌、乳腺癌、结肠癌和前列腺癌中的表达缺失。Jiang Y等[5]研究人体的肝癌细胞中的PDCD4的表达情况，并和周围正常组织进行对照，发现肝癌组织中呈现显著的低表达。Gao等[6]对手术切除的胶质瘤患者标本30例进行分析，结果提示，PDCD4mRNA、蛋白质相比癌旁组织表达频率均有不同程度缺失。

目前研究认为，PDCD4主要通过抑制肿瘤细胞转录和翻译过程抑制肿瘤的生长，但详细机制尚不清楚。核转录因子AP－1参与细胞的增殖、分化与转化过程[7]，在肿瘤的形成、侵袭和转移中具有重要作用。PDCD4可能通过抑制AP－1的表达抑制肿瘤细胞的生长。其次PDCD4通过与翻译起始因子elF4A结合抑制蛋白质的翻译过程。突变分析表明，PDCD4MA－3区氨基或羧基末端发生突变后，与elF4A结合率降低约90%，从而不能竞争性抑制elF4G的结合，不能抑制翻译起始过程的进行，导致细胞过度增殖[8]。近来研究发现，微小RNA(miRNA)的异常表达与肿瘤的发生密切相关。在PDCD4mRNA的3＇端非编码区存在着miR－21的结合位点，这个位点的功能能够调节PDCD4的水平[9]。Lund等[10]研究发现，在乳腺癌中，miR －21 下调靶基因PDCD4，促进了肿瘤细胞的转化。另外，PDCD4可能还通过影响细胞周期的进程[4]，激活 PI3K－Akt－mTOR－p70S6K信号途径[11]等途径影响肿瘤的发生、发展。

本研究发现，PDCD4在NSCLC组织、癌旁组织中表达不同，分别为33.3%、75.0%，PDCD4在NSCLC中和正常肺组织相比存在着低表达和缺失，且两者相比差异有显著性。PDCD4表达缺失可能参与了NSCLC的发生和发展，可作为NSCLC的病理诊断的指标。Kalinichenko SV等[12]研究发现，在鳞癌标本中，PDCD4蛋白通常没有改变，甚至上调。本组研究结果与之不同，鳞癌患者PDCD4蛋白表达亦较正常组织有显著的减低。本组在有吸烟史的患者中PDCD4蛋白的表达阳性率为25.0%，无吸烟史的患者为38.2%，差异有统计学意义。是否与烟草中的毒性物质长期吸入影响肺癌组织中PDCD4的表达，从而促使细胞的恶性增殖，有待进一步研究。Chen Y等[2]研究认为，PDCD4表达丢失的患者肿瘤恶性程度较高，一般为Ⅲ期的患者。本组资料也提示PDCD4Ⅲ～Ⅳ期的患者PDCD4缺失率更高，与Ⅰ期、Ⅱ期相比差异有统计学意义，提示随着肿瘤的进展，PDCD4表达缺失率提高。而Ⅰ期和Ⅱ期相比差异无统计学意义。另外，分化差的癌组织PDCD4的缺失显著，本组病例中低、中和高分化的癌组织中PDCD4的表达分别为16.7%、29.0%、63.6%，低、中分化组较高分化组差异均有统计学意义。Chen Y等[2]通过对124例原发型肺癌的所有亚型进行免疫组化检测，得出结果:PDCD4表达丢失的患者肿瘤恶性程度较高，PDCD4表达丢失的患者术后随访病死率高于表达正常的患者。因此，PDCD4可作为NSCLC的一个预后指标。本组资料研究表明，在年龄≥60岁组和＜60岁组、性别、组织类型之间PDCD4表达没有差异。

张霞等[13]在神经胶质瘤研究中成功地将重组PDCD4基因转染至U251细胞，细胞表达PDCD4后，其细胞增殖明显受到抑制。Gao F等[14]发现，在神经胶质瘤组织中恢复PDCD4基因的表达，能够抑制细胞增殖和复制能力，提示PDCD4基因的重新激活可以作为胶质瘤治疗的一种新的有效措施。因此，提高肿瘤PDCD4的表达，有可能成为NSCLC靶向治疗途径。

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