前额叶切除对沙鼠学习与记忆和海马CA1区胆碱能神经元的影响

王贵振 李建民 史 强 范卫庆

(山东省新泰市人民医院神经外科 山东 新泰 271200;①河北联合大学附属医院神经外科)

学习、记忆是人脑的重要功能之一。通过功能核磁共振成像的研究发现，前额叶皮质在工作记忆的过程中发挥着很重要的作用。大脑海马区与大脑皮层(前额叶)的临时信息交流，对于记忆的形成与储存起关键作用，在两个区域的信息交流过程中，大脑皮层神经系统的结构也做出相应的调整。海马的结构、解剖学位置以及纤维联系的特点，都提示它可能在学习和记忆中起重要作用。为了证实前额叶皮质在学习记忆中的作用，我们制作了前额叶皮质切除沙鼠模型，并观察术后海马CA1区形态变化，进一步探讨海马及前额叶在学习记忆中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制作 选取29只健康蒙古沙土鼠(购于浙江省实验动物中心)，清洁级，体质量60～80g，雌性，9～12周龄。将其随机分成正常对照组、假手术组、前额叶切除7天组和前额叶切除21天组。假手术组暴露前额叶。按参考文献[1]报道的方法制作前额叶皮质切除模型。在(22±1)℃环境温度下，将沙鼠予3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后，固定于立体定向仪上。切开头皮，暴露颅骨，在冠状缝前1.0mm、矢状缝旁开2mm处用显微磨钻钻1个小骨窗，用显微持针器扩大骨窗。用自制吸引器吸除冠状缝前约1.0mm至额极的右侧额叶背外侧皮质，作1个4mm×3mm×1mm大小的创腔，用明胶海绵填塞止血后缝合头皮。各组动物在手术完成7天或21天后进行4－PTT旱路迷宫实验，测试学习记忆能力。

1.2 脑组织形态结构观察 取迷宫实验完成后动物前囟后2.5～4.0mm之间的大脑部分进行常规脱水，石蜡包埋，切片行H－E染色。海马神经元损伤的评价:在Olympus光镜下观察海马CA1区锥体层细胞形态变化并计数单位高倍视野(400×)下的神经元数，即神经元密度(Neuronal density，ND)。我们在左右两侧海马各任取3个高倍视野(400×)记数，取平均值。

1.3 胆碱能神经元观察 石蜡切片，常规脱蜡至水。按试剂盒说明行CHAT免疫组化染色。在显微镜下计数两侧海马CA1区各3个高倍视野(400×)范围内的CHAT阳性细胞并取平均值。

1.4 4－PTT旱路迷宫实验 4－PTT旱路迷宫是日本山形大学医学部神经机能研究室与华北煤炭医学院联合研制开发的评价学习记忆能力的实验装置(主要用于评价不悉水性的蒙古沙鼠)，通过记录沙鼠自然环境下进入迷宫的摄食情况，可以同时测试动物的活动状况、紧张状态、行动反应及学习记忆等情况。本实验主要采用的检测指标为:①达到完成标准所需的实验次数(tests of reaching completing standard，TRSC);②每次完成实验所用的 时间(t time of completing three pellets，TCFP);③每次实验中从开始到吃掉第1个食丸所用的时间 (time of completing first pellet，TCTP);④每次实验中的正确错误数(correct error CE)。指标①、②、③主要观察动物通过训练后能正确完成实验的情况，反映动物参照记忆的形成，指标④主要观察动物进入无食物盒次数、重复进入已吃掉食物食盒次数，反映动物工作记忆的形成[2]。

1.5 统计学处理 实验结果用均数±标准差表示，用SAS8.20版统计软件包进行完全随机设计的方差分析，P＜0.05认为差异有显著性。

2 结果

2.1 学习记忆测试结果 前额叶皮质切除7天组和21天组各学习记忆指标均差于假手术组，差异有显著性(P＜0.05)，说明前额叶切除使沙鼠的学习记忆受到损害。前额叶皮质切除21天组各学习记忆指标均差于7天组，差异有显著性(P＜0.05)，说明前额叶皮质切除后随着时间的延长，学习记忆的损害加重。见表1。

2.2 病理结果(HE染色) 显微镜观察前额叶损伤组海马CA1区神经元部分变性坏死，细胞间隙加大，空泡样变，部分细胞核浓缩、深染，溶解、消失。

2.3 CHAT免疫组织化学结果 显微镜观察发现正常对照组和假手术组沙鼠海马CA1区阳性胆碱能神经元结构完整，排列整齐致密，可见2～3层细胞，细胞核染色淡，核仁清晰，胞浆染成深棕色，未见明显变性坏死的神经元。见图1。前额叶切除组可见海马CA1区阳性胆碱能神经元排列稀疏，胞浆染成浅棕色，可见变性坏死的神经元。见图2和表2。

表1 各组工作记忆与参照记忆的比较()

表1 各组工作记忆与参照记忆的比较()

注:与假手术组比较，*P＜0.05;与前额叶切除7天组比较，▲P＜0.05

组别 例数 TRCS(次数) TCFP(s) TCTP(s) CE(次数)2.3 ±0.5 40.8 ±10.7 99.0 ±14.1 2.0 ±0.7假手术组 6 2.6 ±0.5 34.2 ±12.7 104.7 ±20.5 2.2 ±1.3前额叶切除7 天组 8 5.0 ±0.9* 90.3 ±11.9* 209.3 ±53.6* 5.3 ±2.4*前额叶切除21天组 8 7.0±1.0＊▲ 119.8±20.4＊▲ 274.8±55.8＊▲ 8.4±2.2正常对照组7＊▲

表2 各组海马CA1区神经元密度与阳性胆碱能神经元的比较()

表2 各组海马CA1区神经元密度与阳性胆碱能神经元的比较()

注:与对照组比较，*P＜0.05;与前额叶切除组比较，#P＜0.05

正常对照组7 32.6 ±2.6 27.3 ±1.9假手术组 6 33.2 ±2.5 26.3 ±2.2前额叶切除7 天组 8 24.2 ±3.0* 20.8 ±1.9*前额叶切除21 天组 8 20.6 ±1.6*# 17.8 ±2.2*#

图1 对照组海马CA1区CHAT染色阳性胆碱能神经元的显微镜下变化(免疫组化400×)

图2 前额叶切除21天组海马CA1区CHAT染色阳性胆碱能神经元的显微镜下变化(免疫组化400×)

3 讨论

前额叶皮层是个体发育中最迟成熟的大脑新皮层，是所有皮层中功能最复杂、了解最少的部位[3]。现在大多数研究认为前额叶皮层在工作记忆中起着关键作用，尤其是执行控制功能。执行控制具体化的两个最基础方面是:①注意与抑制;②任务管理[4]。在 fMRI研究中[5～7]，前额叶皮层在这两个学习记忆过程中均可观察到明显激活。这些都说明前额叶皮层在工作记忆中起着极其重要的作用。乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)是第1个被发现的中枢神经递质。中枢胆碱能递质在学习与记忆中有重要的调节作用，保持其功能正常，是维持哺乳动物学习记忆正常进行的必要条件[8]。大脑新皮质和海马之间也有广泛的胆碱能纤维的相互联系。胆碱乙酰化酶(CHAT)在胆碱能神经元胞体内合成，是胆碱能神经元的特殊标志。前额叶皮质切除2周后，就可见到海马CA1区的胆碱能神经元减少。且4周后胆碱能神经元进一步减少，与学习记忆的损害相平行。前额叶皮质切除后学习记忆的损害可能与前额叶皮质胆碱能神经元的直接缺失和海马CA1区胆碱能神经元的迟发性坏死相关。而吴佐泉[9]也报道损伤前额叶可导致基底前脑胆碱能神经元迟发性死亡，这可能是学习记忆发生迟发性损害的一个原因。因为胆碱能神经元释放的递质乙酰胆碱(Ach)在学习记忆过程中起着重要作用，而皮质胆碱能神经元的直接缺失和海马CA1区胆碱能神经元的迟发性坏死导致了乙酰胆碱分泌不足。乙酰胆碱分泌不足导致了相关功能的障碍。通过制作沙鼠前额叶皮质切除模型，证实产生了学习记忆的损害，为以后益智类药物的测试及学习记忆机制的研究等提供一种新的途径。当然此模型还需进一步验证和完善。

[1]吴佐泉，王溶杨，马廉亭，等.胎脑组织移植对额叶皮层损伤大鼠辨别学习，记忆之影响[J].中华器官移植杂志，1997，18(1):42

[2]李建民，陈长香，赵雅宁，等.川穹嗪对沙鼠前脑缺血－再灌注损伤后学习记忆的影响[J].河北医药，2010，32(1):20

[3]唐晓伟，孟庆元.大鼠下丘脑室旁核与终纹床核及前额叶皮质间纤维联系的研究[J].生物学杂志，2010，27(5):45

[4]Smith EE and Jonides J.Storage and executive processes in the frontal lobes[J].Science，1999，283:1657

[5]吴 凡，余永强，王海宝.情绪记忆的功能成像研究进展[J].国际医学放射学杂志，2010，33(1):3

[6]张 敬，任 华，张 权，等.正常人工作记忆任务和静息状态下前额叶皮层内侧面的功能连接分析[J].临床放射学杂志，2009，28(9):1197

[7]李传明，王 健，王 新，等.阿尔茨海默病前额叶注意功能区fMRI定量研究[J].中国医学影像技术，2009，25(5):760

[8]万选才，杨天祝，徐承焘.现代神经生物学[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1999.127

[9]吴佐泉，赵慧生，丁继兵.额叶皮质损伤对大鼠基底前脑胆碱能神经元的影响[J].中国神经科学杂志，2001，17(1):80