硬膜外腔注入亚甲蓝对大鼠腰椎脊髓及脊神经节功能的电生理影响

刘春雨，彭宝淦，高春华，金 丽

亚甲蓝作为一种氧化还原剂，临床上曾广泛用于高铁血红蛋白血症和氰化物中毒的解毒药物，但亚甲蓝可用于神经阻滞近年来也为人们所关注。有关亚甲蓝的止痛作用机制，多数学者认为亚甲蓝是一种鸟苷酸环化酶抑制剂，可通过影响脊髓内的一氧化氮/ 环鸟核糖单磷酸盐系统(NO2cGMP)的兴奋性起阻断痛觉传导的作用，而非通过损害神经髓质来实现［1］。还有学者认为亚甲蓝为受氢体，其色素受氢后使无髓鞘神经纤维着色，从而阻止了感觉神经的传导，加之其参与糖代谢，能促进丙酮的继续氧化，改善神经阻滞，达到止痛目的［2］。所以亚甲蓝能灭活长入椎间盘内的神经末梢或伤害感受器，就能打断椎间盘源性疼痛的传导通路［3］。但将亚甲蓝应用在硬脊膜外腔的安全性尚需进一步探讨。本实验旨在观察亚甲蓝从小剂量到大剂量在不同时间段内对硬脊膜的急性、亚急性反应，为临床治疗提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本次实验以正常5 月龄120 只清洁级Wistar 大鼠(北京科宇动物养殖中心提供)为实验对象，雌雄不限，体重为240～260 g。经统计学检验，120 只纳入实验研究的Wistar 大鼠在年龄、体重等方面的差异均无统计学意义(P ＞0.05)。

1.2 实验主要仪器及试剂

①VC-10(日本光电生物电放大器BP)，中国军事医学科学院动物中心提供;②微量注射泵SEN-3201，中国军事医学科学院动物中心提供;③电刺激器(BS)，中国军事医学科学院动物中心提供;④隔离器，中国军事医学科学院动物中心提供;⑤MED1401 Spike-Ⅱ(英国CED 公司)，中国军事医学科学院动物中心提供;⑥生物电信号采样分析系统，中国军事医学科学院动物中心提供。

1.3 主要试剂

①亚甲蓝注射液，山东华鲁制药有限公司，批号201106121;②青霉素钠注射液，哈药集团制药总厂，批号A2920118734;③利多卡因注射液，北京制华天制药集团总厂，批号CS345176332;④速眠新注射液，中国军事医学科学院动物中心提供，批号57890456。

1.4 实验方法及分组

120 只大鼠随机平均分为5 组，包括空白对照组、生理盐水对照组、1%亚甲蓝0.2 mL 组、1 mL 组和2 mL 组，每组24 只。5 组均包括4 个监测时间点(30 min、2 h、24 h 及72 h)，每个时间点6 只。

分别用速眠新注射液腹腔注射麻醉，4 mL/kg。行气管插管，大鼠俯卧位，暴露L3/L4/L5节段，切除棘突及椎板，显微镜下充分暴露L3/L4/L5脊髓硬膜外腔及神经根，手术中避免损伤脊髓及神经根，如不慎将脊髓及神经根损伤的不纳入本实验各组列中。在硬膜外腔及神经根处注入相应注射液。记录各组各时间点L3～5神经根诱发电位幅度、潜伏期、阈值变化。用于监测注射后24 h 和72 h 2 个时间点的实验动物在第1 次麻醉暴露腰椎相应节段后给药，用青霉素钠冲洗切口抗感染，然后逐层缝合切口，继续饲养，恒温保暖，供食供水，待到实验组相应时间段后再次麻醉给行电生理上述各指标检测。4 个时间段分别在立体定位仪固定，拉起皮瓣，缝制油槽，内充37°C 左右的液体石蜡油以防干燥。分别在大鼠的双侧L3～5后根神经节近神经纤维悬挂于双极铂金丝电极上，电刺激大鼠坐骨神经，接地电极均置于皮下，分别记录双侧L3/L4/L5脊神经节诱发电位幅度、潜伏期、阈值的变化。刺激参数:刺激时采用单个方波电刺激，延迟10 ms;持续时间1 ms。刺激开始时调整隔离器的旋钮由大到小，当动作电位出现时加大刺激强度至1.5 倍阈值刺激持续10 s。每次刺激间隔时间不少于5 min，刺激3 次取平均值。

1.5 统计学分析

2 结 果

2.1 诱发电位幅度

空白组、盐水对照组、亚甲蓝0.2 mL 组、亚甲蓝1 mL 组、亚甲蓝2 mL 组在30 min、2 h、24 h、72 h 内所引起脊髓L3～5脊神经根诱发电位幅度指标各组相比差异无统计学意义(P ＞0.05，见表1～3)。

2.2 诱发电位潜伏期

空白组、盐水对照组、亚甲蓝0.2 mL 组、亚甲蓝1 mL组、亚甲蓝2 mL 组在30 min、2 h、24 h、72 h 内引起脊髓L3～5脊神经根诱发电位潜伏期指标差异无统计学意义(P ＞0.05，见表4～6)。

2.3 诱发电位阈值

空白组、盐水对照组、亚甲蓝0.2 mL 组、亚甲蓝1 mL组、亚甲蓝2 mL 组在30 min、2 h、24 h、72 h 内引起脊髓L3～5脊神经根诱发电位阈值指标差异无统计学意义(P ＞0.05，见表7～9)。

表1 亚甲蓝溶液对大鼠脊髓及L3 脊神经根诱发电位幅度影响Tab.1 Effect of methylene blue solution on evoked potential amplitude of spinal cord and L3 spinal nerves in rat

表2 亚甲蓝溶液对大鼠脊髓L4 脊神经根诱发电位幅度影响Tab.2 Effect of methylene blue solution on evoked potential amplitude of spinal cord and L4 spinal nerves in rat

表4 亚甲蓝溶液对大鼠脊髓L3 脊神经根诱发电位潜伏期影响Tab.4 Effect of methylene blue solution on evoked potential latency of spinal cord and L3 spinal nerves in rat

表5 亚甲蓝溶液对大鼠脊髓L4 脊神经根诱发电位潜伏期影响Tab.5 Effect of methylene blue solution on evoked potential latency of spinal cord and L4 spinal nerves in rat

表6 亚甲蓝溶液对大鼠脊髓L5 脊神经根诱发电位潜伏期的影响Tab.6 Effect of methylene blue solution on evoked potential latency of spinal cord and L5 spinal nerves in rat

表7 亚甲蓝溶液对大鼠脊髓L3 脊神经根诱发电位阈值的影响Tab.7 Effect of methylene blue solution on evoked potential threshold value of spinal cord and L3 spinal nerves in rat

表8 亚甲蓝溶液对大鼠脊髓L4 脊神经根诱发电位阈值的影响Tab.8 Effect about Methylene blue solution on the evoked potential Threshold value of spinal cord and L4 spinal nerves in rat

表9 亚甲蓝溶液对大鼠脊髓L5 脊神经根诱发电位阈值的影响Tab.9 Effect about Methylene blue solution on the evoked potential Threshold value of spinal cord and L5 spinal nerves in rat

3 讨 论

亚甲蓝为强氧化的还原剂，在体内的不同浓度变化会使其效果也有不同的作用。亚甲蓝对血红蛋白来说就有2 种不同的作用。首先亚甲蓝在低浓度时6-磷酸-葡萄糖脱氢过程中的氢离子经还原型三磷酸吡啶核苷传递给亚甲蓝，使其转变为还原型的白色亚甲蓝;白色亚甲蓝又将氢离子传递给带Fe3+的高铁血红蛋白，使其还原为带Fe2+的正常血红蛋白，而白色亚甲蓝又被氧化为亚甲蓝。亚甲蓝的还原-氧化过程可反复进行。其次亚甲蓝在高浓度时，亚甲蓝不能被完全还原为白色亚甲蓝，因而起氧化作用，将正常血红蛋白氧化为高铁血红蛋白。由于高铁血红蛋白易与CN-结合形成氰化高铁血红蛋白，但数分钟后二者又离解，故仅能暂时抑制CN-对组织中毒的毒性。

自从亚甲蓝首次在1876 年合成以来，已用于许多医学领域［4］。除其他作用外，它还是一种神经毁损剂，已成功用于治疗皮肤瘙痒症和急性骨折［5-8］，这种神经毁损作用是治疗椎间盘源性腰痛的理论依据。破坏神经髓梢，起神经阻滞作用。亚甲蓝是一种化学性质活泼的氧化还原剂，与神经组织具有良好的亲和力，对神经产生不同程度的可逆性损害作用，直接阻碍神经组织的电传导，阻断痛觉传导，已被广泛应用于治疗多种疼痛性疾病［9］。另外，动物实验发现，亚甲蓝作为鸟苷酸环化酶抑制剂，通过降低局部组织中的鸟苷酸浓度，阻断缓激肽诱导的痛觉过敏，表明亚甲蓝可以消除局部组织炎症引起的痛觉过敏反应［10］。有学者研究发现［11-13］，椎间盘源性腰痛患者病理疼痛椎间盘的特征性改变是沿着由纤维环外层到髓核的裂隙形成由大量神经纤维分布的血管肉芽组织条带区。研究清楚地表明，在血管肉芽组织区域内有丰富的P 物质阳性神经，局部炎症可能刺激肉芽组织内的疼痛感受器而产生疼痛。如果能够毁灭这些肉芽组织内的疼痛感受神经纤维和神经末梢，椎间盘来源的疼痛可能会减轻或缓解。

亚甲蓝治疗椎间盘源性腰痛时，亚甲蓝顺着髓核到纤维环外层的裂隙流出，到椎管内硬膜外腔后是否会渗透到脊髓内对脊髓神经结构产生影响。研究显示亚甲蓝注入腰椎硬膜外腔后主要是硬脊膜屏障作用发挥其功能，1%亚甲蓝无法渗透过硬脊膜屏障。本实验中的0.2 mL、1 mL、2 mL 的1%亚甲蓝分别注入L3/L4/L5节段硬膜外腔，在30 min、2 h、24 h、72 h 的时间段内，将L3～5脊神经根诱发电位幅度、潜伏期以及阈值的变化，与正常对照组及盐水对照组相比无显著性差异，用统计学方法计算相关统计学数据差异无统计学意义(P ＞0.05)。由此可推断1%亚甲蓝对腰椎脊髓及神经根传导功能没有影响。

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