肿节风炭疽病病原学研究及其对药材质量的影响

2012-06-12 03:10唐美琼蓝祖栽黄永才白隆华
植物保护 2012年4期
关键词:炭疽病孢子病斑

蒋 妮, 唐美琼, 蓝祖栽, 黄永才, 林 杨, 白隆华

(广西药用植物园,广西药用资源保护与遗传改良重点实验室,南宁 530023)

肿节风[Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai]又名草珊瑚、九节茶,为金粟兰科(Chloranthaceae)草珊瑚属(Sarcandra)多年生草本植物,以全草入药,具有清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效,为中国药典收录品种[1],同时也是广西瑶族地区民间流传的“七十二风”传统瑶药中的重要品种[2]。近年来,随着肿节风产品的不断开发,肿节风药材资源日益紧俏,为此,广西药用植物园在广西融安、东兰等地开展了肿节风的规范化栽培研究工作,并在南宁建立肿节风种质资源圃。在此过程中发现植株地上部分受病害危害较为严重,主要在叶片上表现出褐色枯斑,引起叶片大量枯萎。目前关于肿节风叶斑类病害国内外尚未见报道,为此,笔者在肿节风种质资源圃对该病害的发生情况进行定期调查,并进行病原分离鉴定及生物学特性研究,以期为病害的识别及防治提供理论依据。

目前,关于药用植物病害与药材质量的关系研究报道很少。王喜军报道龙胆斑枯病不但会造成产量损失,同时也会使药材质量变劣,有效成分含量下降[3]。高微微等[4]研究根部病害对西洋参根不同部位主要皂苷含量的影响,结果发现:发生根病的西洋参根中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量之和低于正常参根;其中Rb1受根病的影响最为明显,随着病害程度加重而显著下降。据田间调查,肿节风炭疽病可危害植株叶、叶柄及茎,由于肿节风全株入药,生产中感病的药材通常也被采收入药。研究肿节风炭疽病不同病情对肿节风产量和质量的影响,正确评价该病害对肿节风生产造成的影响,不仅利于制定防治指标,做出正确防治决策,而且对于肿节风药材的质量控制具有重要的参考价值。

1 材料和方法

1.1 肿节风炭疽病田间发生情况调查

2008年在南宁广西药用植物园肿节风种质圃进行调查,每月下旬调查1次。采取随机取样,调查20株,每株上、中、下各查10片叶,共查600片叶。分级调查,统计病害发生率和病情指数。

参考谢玲等[5]方法制定肿节风炭疽病分级标准。

0级:叶片无病斑;

1级:病斑面积占整个叶面积的10%以下;

2级:病斑面积占整个叶面积的10%~29%;

3级:病斑面积占整个叶面积的30%~50%;

4级:病斑面积占整个叶面积的50%以上。

病情指数=∑(病级叶片数×代表数值)/(调查叶片总数×发病最重级别的代表数值)×100。

1.2 病原菌鉴定

1.2.1 菌株分离

采摘新感病的肿节风病叶,常规组织分离法分离,将分离到的菌株单孢纯化后置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 致病性测定

采取针刺菌片接种方法接种叶片,以接种PDA培养基作为对照,在室温(20~25℃)下保湿培养5d,记录发病情况,对比发病后症状并再分离病原作柯赫氏验证[6]。

1.2.3 形态学鉴定

将致病菌株移至PDA平板上28℃下进行培养,按玻片培养法观察和记载病菌的形态特征[6],结合菌落形态、病害的症状,参考魏景超[7]《真菌鉴定手册》进行病原菌种属鉴定。

1.2.4 分子鉴定

采用SDS法提取病原菌株的基因组DNA[8]。采用真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITS4(5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′)和ITS5(5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3′)(上海捷瑞生物工程有限公司合成),扩增该菌的rDNA-ITS序列。扩增产物的纯化和序列测定委托北京诺赛生物科技有限公司进行,所得到的核苷酸序列与GenBank中相关序列进行同源性比较[9]。

1.3 生物学特性测定[6]

1.3.1 温度对菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响

将病原菌接种于PDA平板上,分别在6、12、18、24、26、28、30、35℃和40℃下培养4d,十字交叉法测量菌落直径;培养7d后在每个培养皿中加入10mL无菌水,用毛笔将孢子刷下,纱布过滤后用血球计数器计数,计算产孢量[10];每个处理设3次重复。

用0.5%葡萄糖液配制分生孢子悬浮液(浓度为低倍镜下每个视野30~50个分生孢子),分别在上述不同温度下培养12h,镜检300个孢子的萌发情况,孢子的萌发以芽管的长度超过孢子直径的一半为标准(下同),统计萌发率。每个处理设3次重复。

分生孢子萌发率=(萌发孢子总数/300)×100%。

1.3.2 pH对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

将病原菌接种于pH 为3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA平板上,28℃下培养4d,测量菌落直径和产孢量(方法同1.3.1);配制孢子悬浮液(方法同1.3.1),并调成上述不同的pH,28℃下培养12h,镜检萌发情况。每个处理设3次重复。

1.3.3 光照处理对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

将直径为6mm的菌碟移入PDA平板,分别采用连续光照、完全黑暗和12h光暗交替3种条件,于28℃下培养,4d后测菌落直径,7d后测产孢量。每处理重复3次。

1.4 罹病肿节风植株中异嗪皮啶含量测定[1]

1.4.1 样品及试剂

试验所用肿节风均采自广西药用植物园肿节风种质圃,将不同病情指数的肿节风编号分类后,经自然干燥,备用,不感病植株作对照。试验所用的异嗪皮啶对照品由中国药品生物制品检定所提供(批号:110837-200304);甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯。

1.4.2 主要仪器

VARIAN210型高效色谱仪。

1.4.3 供试品的制备

取肿节风药材样品粉末(过3号筛),精密称取1g粉末,置具橡胶塞的圆底烧瓶中,精密加入50%甲醇25mL,密闭塞紧,称定重量,加热回流1h放冷,再称定重量。用甲醇补足减少的重量。用微孔滤膜过滤,即得供试品溶液。

1.4.4 色谱条件

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,参照《中国药典》(2010)肿节风含量测定方法测定,即得。色谱条件为:色谱柱Sun-FireTM-C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相乙腈—0.1%磷酸溶液(20:80);流速1.0mL/min;温度30℃;检测波长342nm。

1.4.5 标准曲线

依次吸取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL 标准液注入高效液相色谱仪,以进样量(x)为横坐标,色谱峰面积(y)为纵坐标,得回归方程:y=129.96x-29.338,R=0.999 9,进样量在0.102~0.605μg范围内线性关系良好。

1.4.6 对照品溶液的制备

称取异嗪皮啶对照品1.97mg,加入定量甲醇稀释,吸取定量稀释液用10mL容量瓶定容,加入定量甲醇稀释,配成10μg/mL的对照品溶液。

2 结果和分析

2.1 病害调查

田间症状主要表现在植物叶片上(图1a)。发病初期在叶片上呈现圆形、椭圆形红褐色小斑点,后期扩展成深褐色圆形病斑,中央则由灰褐色转为灰白色,病斑边缘有黄色晕圈,最后病斑转为黑褐色,并产生轮纹状排列的小黑点。严重时一个叶片上有十多个至数十个病斑,后期病斑穿孔,病斑多时融合成片导致叶片干枯。病原菌也可侵染叶柄、茎部,通常会出现圆形或近圆形的病斑,呈淡褐色,其上生有轮纹状排列的黑色小点,后期病斑部缢缩,叶柄或茎折断。茎部染病(图1b),可产生与叶片上相似的症状,但多从叶腋处先发生,并向新生枝及主茎扩展,造成病部变褐,凹陷,病斑多为圆筒形或长椭圆形。严重时,病斑可以布满茎表,并可串连成片,使茎的表皮呈黑褐色,严重影响养分的运输,造成植株生长衰弱,部分病株枯死。

图1 肿节风炭疽病症状

田间病情调查结果表明肿节风炭疽病在南宁周年均有发生(图2)。1-5月及11-12月的病情指数相对较低,均小于30;5-9月份随着温度的升高及降水的增加,病情指数不断升高,8、9月的病情指数达到高峰,分别为61.06和54.78。田间调查发现老叶多从4月初开始发病,5-6月迅速发展,新叶则多从8月开始发病。病菌以菌丝体、分生孢子或分生孢子盘在寄主残体或土壤中越冬,分生孢子靠风雨、浇水等传播。田间栽植过密、通风不良、叶子相互交叉更容易感病。

图2 肿节风炭疽病田间周年发生情况

2.2 病原菌鉴定

2.2.1 致病性测定

接种叶片在室温下保湿培养5d后,针刺接种的叶片表现出与自然发生的叶枯病相似的症状(图1c),病斑初为斑点状,逐渐扩展成圆形或椭圆形大斑,深褐色,且由于温湿度条件好,生长旺盛,7d后病斑迅速蔓延至叶缘,从发病叶片上再分离的病菌与原接种菌株相同,证实了原接种菌株为致病菌,伤口为该菌对寄主成功侵染的前提条件之一。以同样的方法得到病叶柄的致病菌,经鉴定与叶片致病菌为同一菌。

2.2.2 病原菌的形态学鉴定

在PDA培养基上菌落圆形,边缘整齐,初为浅灰白色,后转深烟灰色至黑褐色,培养皿反面,菌落以接种点为中心,呈数圈黑褐色同心轮纹。菌丝体白色,气生菌丝平铺,绒毛状,后期菌落中央形成土红色黏稠孢子团。分生孢子盘黑褐色,褥座状,有刚毛,顶端稍尖、黑褐色,有分隔。分生孢子新月形、单孢、无色,基部稍钝,顶端稍尖,内含1个油球,大小为(18.5~25.8)μm× (3.0~4.2)μm,附着胞(10.2~13.6)μm×(6.8~8.6)μm,深褐色,不规则三角形。据上述特征初步鉴定该种病原菌为炭疽属真菌(Colletotrichumsp.)。

2.2.3 病原菌的rDNA—ITS序列分析

采用通用引物ITS4/ITS5对菌株的rDNA—ITS序列进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测,得到大小约为600bp的片段,经序列测定,该片段全长554bp(图3)。将上述测序结果在GenBank中进行同源性分析,该病原菌株与Colletotrichum dematium的同源性达99%。结合形态鉴定确定该病原菌为黑线炭疽菌(Colletotrichum dematium)。

图3 菌株ITS-rDNA片段序列

2.3 菌株生物学特性

2.3.1 温度对菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响

黑线炭疽菌在6~35℃均能够生长,12~35℃生长良好,适宜生长温度为26~28℃,40℃菌丝停止生长,不产孢子。

2.3.2 pH对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

表2试验结果表明:黑线炭疽菌的菌丝体在弱酸、弱碱和中性条件下生长良好,随着酸碱度的增加,菌丝体的生长活性逐渐降低;pH为5时产孢量最大;pH为11时产孢量最小;黑线炭疽菌在中性或近中性条件下孢子萌发率最高,随着酸度或碱度的增加,孢子萌发率逐渐降低,在pH为7时黑线炭疽菌的孢子萌发率达最大值,pH为3时孢子萌发率均为最小值。

2.3.3 光照处理对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

结果如表3所示,黑线炭疽菌菌丝生长及产孢对光均不敏感,在所有的光环境下均保持较好的长势,差异不显著。在黑暗环境下的孢子萌发率较低,说明光照有利于孢子萌发。

表3 光照处理对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响1)

2.4 罹病肿节风的药材质量

表4结果显示:轻微感病(病情指数<10)的肿节风药材,异嗪皮啶含量与健康植株含量相同,药材质量未受影响;病情指数>10的肿节风药材,与健康植株相比异嗪皮啶含量均有所减少;除了病情指数为30~40范围的肿节风药材,其他感病药材的异嗪皮啶含量都随着病情的加重而降低;当病情指数增加到60~70,异嗪皮啶含量显著低于健康植株,且在病指数达90~100,异嗪皮啶含量为0.019 6%,低于药典要求(不得少于0.020%)。可见,病情指数范围60~70,是异嗪皮啶含量的临界期,大于此临界值,对药材质量影响较大。

表4 肿节风炭疽病不同病情指数异嗪皮啶含量及植株鲜重

随着病情的发展,肿节风炭疽病所造成的产量损失逐渐增加。病害发生初期(病情指数<50),病害对产量所造成的损失较小,植株鲜重减少3.04%~6.44%;病情指数50~60时,病害所造成的损失显著增加,植株鲜重减少了34.56%,当病情指数>90,大部分叶片及茎干均干枯,植株鲜重减少至62.32%。可见,病情指数范围在50~60,植物鲜重为一个临界期,大于此范围的发病情况会对药材产量影响较大。

综合考虑药材产量和质量,建议病情指数50~60,就需开始进行病害的防治工作。

3 结论与讨论

炭疽病是植物常见病害,多为炭疽菌属真菌引起[11],现 有 文 献 报 道 黑 线 炭 疽 菌 (Colletotrichum dematium)的寄主仅有麦冬、银边沿阶草等植物[12-13]。肿节风是黑线炭疽菌的新记录寄主。

黑线炭疽菌最适宜的生长温度为26~28℃;35℃下菌丝正常生长,但不能产孢,40℃时菌丝不能生长,表明高温可抑制孢子的形成;中性或弱酸、弱碱条件适宜该菌菌丝的生长,孢子的产生及萌发;光照对菌丝的生长、孢子的产生无明显影响,而对孢子的萌发有一定的促进作用。以上结果与前人报道基本一致[12-13]。炭疽菌主要以分生孢子盘、菌丝、分生孢子在土壤、病残枝上越冬,以分生孢子完成初侵染和再侵染[14]。要有效进行防治,还需以其生物学特性为基础,结合环境因子、耕作条件等综合因素,掌握其侵染及流行规律,从而制定包括农事特别是轮作、化学等生态调控的技术措施。

植物病害会影响药材产量和质量[15-16]。本研究结果得出相似的结论:(1)肿节风炭疽病会造成产量损失,随着病情的加重,植株鲜重减少。分析原因是由于病害加重,叶片枯死,从而影响了光合作用,减少了有机物的积累,使产量下降,而这种下降在病情较轻和病害发生初期并不明显,只有到病情特别严重时才表现较为明显。(2)感病肿节风的有效成分含量随病情不同而有一定变化。病情指数>10,有效成分含量均低于健康植株,总体上随着病情的加重,有效成分含量逐渐减低。病情指数大于50的植株,不适宜入药。

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