肿节风炭疽病病原学研究及其对药材质量的影响

蒋 妮， 唐美琼， 蓝祖栽， 黄永才， 林 杨， 白隆华

（广西药用植物园，广西药用资源保护与遗传改良重点实验室，南宁 530023）

肿节风［Sarcandra glabra（Thunb.）Nakai]又名草珊瑚、九节茶，为金粟兰科（Chloranthaceae）草珊瑚属（Sarcandra）多年生草本植物，以全草入药，具有清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效，为中国药典收录品种［1]，同时也是广西瑶族地区民间流传的“七十二风”传统瑶药中的重要品种［2]。近年来，随着肿节风产品的不断开发，肿节风药材资源日益紧俏，为此，广西药用植物园在广西融安、东兰等地开展了肿节风的规范化栽培研究工作，并在南宁建立肿节风种质资源圃。在此过程中发现植株地上部分受病害危害较为严重，主要在叶片上表现出褐色枯斑，引起叶片大量枯萎。目前关于肿节风叶斑类病害国内外尚未见报道，为此，笔者在肿节风种质资源圃对该病害的发生情况进行定期调查，并进行病原分离鉴定及生物学特性研究，以期为病害的识别及防治提供理论依据。

目前，关于药用植物病害与药材质量的关系研究报道很少。王喜军报道龙胆斑枯病不但会造成产量损失，同时也会使药材质量变劣，有效成分含量下降［3]。高微微等［4]研究根部病害对西洋参根不同部位主要皂苷含量的影响，结果发现：发生根病的西洋参根中人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量之和低于正常参根；其中Rb1受根病的影响最为明显，随着病害程度加重而显著下降。据田间调查，肿节风炭疽病可危害植株叶、叶柄及茎，由于肿节风全株入药，生产中感病的药材通常也被采收入药。研究肿节风炭疽病不同病情对肿节风产量和质量的影响，正确评价该病害对肿节风生产造成的影响，不仅利于制定防治指标，做出正确防治决策，而且对于肿节风药材的质量控制具有重要的参考价值。

1 材料和方法

1.1 肿节风炭疽病田间发生情况调查

2008年在南宁广西药用植物园肿节风种质圃进行调查，每月下旬调查1次。采取随机取样，调查20株，每株上、中、下各查10片叶，共查600片叶。分级调查，统计病害发生率和病情指数。

参考谢玲等［5]方法制定肿节风炭疽病分级标准。

0级：叶片无病斑；

1级：病斑面积占整个叶面积的10%以下；

2级：病斑面积占整个叶面积的10%～29%；

3级：病斑面积占整个叶面积的30%～50%；

4级：病斑面积占整个叶面积的50%以上。

病情指数＝∑（病级叶片数×代表数值）／（调查叶片总数×发病最重级别的代表数值）×100。

1.2 病原菌鉴定

1.2.1 菌株分离

采摘新感病的肿节风病叶，常规组织分离法分离，将分离到的菌株单孢纯化后置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 致病性测定

采取针刺菌片接种方法接种叶片，以接种PDA培养基作为对照，在室温（20～25℃）下保湿培养5d，记录发病情况，对比发病后症状并再分离病原作柯赫氏验证［6]。

1.2.3 形态学鉴定

将致病菌株移至PDA平板上28℃下进行培养，按玻片培养法观察和记载病菌的形态特征［6]，结合菌落形态、病害的症状，参考魏景超［7]《真菌鉴定手册》进行病原菌种属鉴定。

1.2.4 分子鉴定

采用SDS法提取病原菌株的基因组DNA［8]。采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物ITS4（5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）和ITS5（5′GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3′）（上海捷瑞生物工程有限公司合成），扩增该菌的rDNA－ITS序列。扩增产物的纯化和序列测定委托北京诺赛生物科技有限公司进行，所得到的核苷酸序列与GenBank中相关序列进行同源性比较［9]。

1.3 生物学特性测定［6]

1.3.1 温度对菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响

将病原菌接种于PDA平板上，分别在6、12、18、24、26、28、30、35℃和40℃下培养4d，十字交叉法测量菌落直径；培养7d后在每个培养皿中加入10mL无菌水，用毛笔将孢子刷下，纱布过滤后用血球计数器计数，计算产孢量［10]；每个处理设3次重复。

用0.5%葡萄糖液配制分生孢子悬浮液（浓度为低倍镜下每个视野30～50个分生孢子），分别在上述不同温度下培养12h，镜检300个孢子的萌发情况，孢子的萌发以芽管的长度超过孢子直径的一半为标准（下同），统计萌发率。每个处理设3次重复。

分生孢子萌发率＝（萌发孢子总数／300）×100%。

1.3.2 pH对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

将病原菌接种于pH 为3、4、5、6、7、8、9、10、11的PDA平板上，28℃下培养4d，测量菌落直径和产孢量（方法同1.3.1）；配制孢子悬浮液（方法同1.3.1），并调成上述不同的pH，28℃下培养12h，镜检萌发情况。每个处理设3次重复。

1.3.3 光照处理对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

将直径为6mm的菌碟移入PDA平板，分别采用连续光照、完全黑暗和12h光暗交替3种条件，于28℃下培养，4d后测菌落直径，7d后测产孢量。每处理重复3次。

1.4 罹病肿节风植株中异嗪皮啶含量测定［1]

1.4.1 样品及试剂

试验所用肿节风均采自广西药用植物园肿节风种质圃，将不同病情指数的肿节风编号分类后，经自然干燥，备用，不感病植株作对照。试验所用的异嗪皮啶对照品由中国药品生物制品检定所提供（批号：110837－200304）；甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯。

1.4.2 主要仪器

VARIAN210型高效色谱仪。

1.4.3 供试品的制备

取肿节风药材样品粉末（过3号筛），精密称取1g粉末，置具橡胶塞的圆底烧瓶中，精密加入50%甲醇25mL，密闭塞紧，称定重量，加热回流1h放冷，再称定重量。用甲醇补足减少的重量。用微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.4.4 色谱条件

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，参照《中国药典》（2010）肿节风含量测定方法测定，即得。色谱条件为：色谱柱Sun－FireTM－C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相乙腈—0.1%磷酸溶液（20：80）；流速1.0mL／min；温度30℃；检测波长342nm。

1.4.5 标准曲线

依次吸取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0μL 标准液注入高效液相色谱仪，以进样量（x）为横坐标，色谱峰面积（y）为纵坐标，得回归方程：y＝129.96x－29.338，R＝0.999 9，进样量在0.102～0.605μg范围内线性关系良好。

1.4.6 对照品溶液的制备

称取异嗪皮啶对照品1.97mg，加入定量甲醇稀释，吸取定量稀释液用10mL容量瓶定容，加入定量甲醇稀释，配成10μg／mL的对照品溶液。

2 结果和分析

2.1 病害调查

田间症状主要表现在植物叶片上（图1a）。发病初期在叶片上呈现圆形、椭圆形红褐色小斑点，后期扩展成深褐色圆形病斑，中央则由灰褐色转为灰白色，病斑边缘有黄色晕圈，最后病斑转为黑褐色，并产生轮纹状排列的小黑点。严重时一个叶片上有十多个至数十个病斑，后期病斑穿孔，病斑多时融合成片导致叶片干枯。病原菌也可侵染叶柄、茎部，通常会出现圆形或近圆形的病斑，呈淡褐色，其上生有轮纹状排列的黑色小点，后期病斑部缢缩，叶柄或茎折断。茎部染病（图1b），可产生与叶片上相似的症状，但多从叶腋处先发生，并向新生枝及主茎扩展，造成病部变褐，凹陷，病斑多为圆筒形或长椭圆形。严重时，病斑可以布满茎表，并可串连成片，使茎的表皮呈黑褐色，严重影响养分的运输，造成植株生长衰弱，部分病株枯死。

图1 肿节风炭疽病症状

田间病情调查结果表明肿节风炭疽病在南宁周年均有发生（图2）。1－5月及11－12月的病情指数相对较低，均小于30；5－9月份随着温度的升高及降水的增加，病情指数不断升高，8、9月的病情指数达到高峰，分别为61.06和54.78。田间调查发现老叶多从4月初开始发病，5－6月迅速发展，新叶则多从8月开始发病。病菌以菌丝体、分生孢子或分生孢子盘在寄主残体或土壤中越冬，分生孢子靠风雨、浇水等传播。田间栽植过密、通风不良、叶子相互交叉更容易感病。

图2 肿节风炭疽病田间周年发生情况

2.2 病原菌鉴定

2.2.1 致病性测定

接种叶片在室温下保湿培养5d后，针刺接种的叶片表现出与自然发生的叶枯病相似的症状（图1c），病斑初为斑点状，逐渐扩展成圆形或椭圆形大斑，深褐色，且由于温湿度条件好，生长旺盛，7d后病斑迅速蔓延至叶缘，从发病叶片上再分离的病菌与原接种菌株相同，证实了原接种菌株为致病菌，伤口为该菌对寄主成功侵染的前提条件之一。以同样的方法得到病叶柄的致病菌，经鉴定与叶片致病菌为同一菌。

2.2.2 病原菌的形态学鉴定

在PDA培养基上菌落圆形，边缘整齐，初为浅灰白色，后转深烟灰色至黑褐色，培养皿反面，菌落以接种点为中心，呈数圈黑褐色同心轮纹。菌丝体白色，气生菌丝平铺，绒毛状，后期菌落中央形成土红色黏稠孢子团。分生孢子盘黑褐色，褥座状，有刚毛，顶端稍尖、黑褐色，有分隔。分生孢子新月形、单孢、无色，基部稍钝，顶端稍尖，内含1个油球，大小为（18.5～25.8）μm× （3.0～4.2）μm，附着胞（10.2～13.6）μm×（6.8～8.6）μm，深褐色，不规则三角形。据上述特征初步鉴定该种病原菌为炭疽属真菌（Colletotrichumsp.）。

2.2.3 病原菌的rDNA—ITS序列分析

采用通用引物ITS4／ITS5对菌株的rDNA—ITS序列进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为600bp的片段，经序列测定，该片段全长554bp（图3）。将上述测序结果在GenBank中进行同源性分析，该病原菌株与Colletotrichum dematium的同源性达99%。结合形态鉴定确定该病原菌为黑线炭疽菌（Colletotrichum dematium）。

图3 菌株ITS－rDNA片段序列

2.3 菌株生物学特性

2.3.1 温度对菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响

黑线炭疽菌在6～35℃均能够生长，12～35℃生长良好，适宜生长温度为26～28℃，40℃菌丝停止生长，不产孢子。

2.3.2 pH对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

表2试验结果表明：黑线炭疽菌的菌丝体在弱酸、弱碱和中性条件下生长良好，随着酸碱度的增加，菌丝体的生长活性逐渐降低；pH为5时产孢量最大；pH为11时产孢量最小；黑线炭疽菌在中性或近中性条件下孢子萌发率最高，随着酸度或碱度的增加，孢子萌发率逐渐降低，在pH为7时黑线炭疽菌的孢子萌发率达最大值，pH为3时孢子萌发率均为最小值。

2.3.3 光照处理对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响

结果如表3所示，黑线炭疽菌菌丝生长及产孢对光均不敏感，在所有的光环境下均保持较好的长势，差异不显著。在黑暗环境下的孢子萌发率较低，说明光照有利于孢子萌发。

表3 光照处理对菌丝生长、产孢和孢子萌发的影响1）

2.4 罹病肿节风的药材质量

表4结果显示：轻微感病（病情指数＜10）的肿节风药材，异嗪皮啶含量与健康植株含量相同，药材质量未受影响；病情指数＞10的肿节风药材，与健康植株相比异嗪皮啶含量均有所减少；除了病情指数为30～40范围的肿节风药材，其他感病药材的异嗪皮啶含量都随着病情的加重而降低；当病情指数增加到60～70，异嗪皮啶含量显著低于健康植株，且在病指数达90～100，异嗪皮啶含量为0.019 6%，低于药典要求（不得少于0.020%）。可见，病情指数范围60～70，是异嗪皮啶含量的临界期，大于此临界值，对药材质量影响较大。

表4 肿节风炭疽病不同病情指数异嗪皮啶含量及植株鲜重

随着病情的发展，肿节风炭疽病所造成的产量损失逐渐增加。病害发生初期（病情指数＜50），病害对产量所造成的损失较小，植株鲜重减少3.04%～6.44%；病情指数50～60时，病害所造成的损失显著增加，植株鲜重减少了34.56%，当病情指数＞90，大部分叶片及茎干均干枯，植株鲜重减少至62.32%。可见，病情指数范围在50～60，植物鲜重为一个临界期，大于此范围的发病情况会对药材产量影响较大。

综合考虑药材产量和质量，建议病情指数50～60，就需开始进行病害的防治工作。

3 结论与讨论

炭疽病是植物常见病害，多为炭疽菌属真菌引起［11]，现 有 文 献 报 道 黑 线 炭 疽 菌 （Colletotrichum dematium）的寄主仅有麦冬、银边沿阶草等植物［12－13]。肿节风是黑线炭疽菌的新记录寄主。

黑线炭疽菌最适宜的生长温度为26～28℃；35℃下菌丝正常生长，但不能产孢，40℃时菌丝不能生长，表明高温可抑制孢子的形成；中性或弱酸、弱碱条件适宜该菌菌丝的生长，孢子的产生及萌发；光照对菌丝的生长、孢子的产生无明显影响，而对孢子的萌发有一定的促进作用。以上结果与前人报道基本一致［12－13]。炭疽菌主要以分生孢子盘、菌丝、分生孢子在土壤、病残枝上越冬，以分生孢子完成初侵染和再侵染［14]。要有效进行防治，还需以其生物学特性为基础，结合环境因子、耕作条件等综合因素，掌握其侵染及流行规律，从而制定包括农事特别是轮作、化学等生态调控的技术措施。

植物病害会影响药材产量和质量［15－16]。本研究结果得出相似的结论：（1）肿节风炭疽病会造成产量损失，随着病情的加重，植株鲜重减少。分析原因是由于病害加重，叶片枯死，从而影响了光合作用，减少了有机物的积累，使产量下降，而这种下降在病情较轻和病害发生初期并不明显，只有到病情特别严重时才表现较为明显。（2）感病肿节风的有效成分含量随病情不同而有一定变化。病情指数＞10，有效成分含量均低于健康植株，总体上随着病情的加重，有效成分含量逐渐减低。病情指数大于50的植株，不适宜入药。

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