基于SSR标记的茶树新品种遗传多样性分析及指纹图谱构建

章志芳，马建强

（中国农业科学院茶叶研究所，国家茶树改良中心，浙江 杭州 310008）

DNA是生物的基本遗传物质，DNA水平上的遗传变异是物种差异最直接的体现。随着分子生物学技术的发展而形成的DNA分子标记技术，因其多态性好、易操作和标准化、不受环境及作物生育期等因素影响等优点，已成为作物品种鉴定最有效的检测手段。在一系列的分子标记体系中，SSR标记以其共显性、操作简单、通用性好、重现性高等优点，成为最广泛应用的分子标记。目前我国建立的DNA指纹数据库大多采用SSR标记体系[1]。

茶树为多年生木本植物，从幼苗期到成熟投产需要几年时间，而在茶树幼苗期通过表型性状进行品种鉴定十分困难，如若品种混杂，势必影响生产效益。因此，开发高效准确的品种鉴定方法对于茶树新品种保护、良种推广等具有重要意义。茶树SSR标记的开发和应用较晚，已发表的茶树SSR标记约300余个[2-4]，且多应用于遗传多样性、遗传结构等研究[5-6]，而在茶树DNA指纹图谱方面的报道较少[7]。笔者利用SSR标记对14个茶树新品种进行遗传多样性分析和分子鉴定，并尝试构建DNA指纹图谱，以期为今后开展茶树分子指纹图谱库构建、新品种鉴定和评价等研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的14个茶树样品（表1）采自中国农业科学院茶叶研究所“国家种质杭州茶树圃”，选取完整、无病虫害感染的一芽二叶新梢，经液氮迅速冷冻后保存于-70℃冰箱中备用。

表1 供试的14个茶树品种

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 采用改进的CTAB法[8]提取基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer检测 DNA浓度，稀释到10 ng/μL用于PCR扩增。

1.2.2 EST-SSR标记 参照乔婷婷[9]、周炎花[10]报道的EST-SSR标记，挑选其中10个多态性较高的标记由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增及产物检测 扩增反应在Bio-Rad PTC-200 PCR仪上进行，反应体系和扩增程序参照乔婷婷[19]的方法。PCR产物用10%的聚丙烯酰胺凝胶在CBS垂直电泳系统上检测，电泳后参照Charters和Wilkinson的方法进行银染显色[11]。

1.2.4 数据统计与分析 每个SSR标记只统计目的片段范围内的一个等位位点，其中每一条多态性条带视为一个等位变异，将电泳图上清晰的条带记为1，同一位置无带或不易分辨的弱带记为0。建立0-1原始数据库，然后将相同的带型组合记为一种基因型；并根据分子质量大小，将等位基因从大到小依次记作 1、2、3等，EST-SSR为共显性标记，对于二倍体茶树而言，一条带表示纯合，两条则为杂合，记录为 11、22、33、12、13、23 等基因型。

使用POPGENE[12]统计每个标记在14个茶树品种中扩增的等位基因数（Observed number ofalleles，Na），计算有效等位位点（Effective number of alleles，Ne）、等位基因频率（Allele frequency），观测杂合度（Observed heterozygosity，HO）、期望杂合度（Expected heterozygosity，HE）、Shannon 信息指数（Shannon’s information index，I）。采用 PowerMarker[13]计算基因型数（Genotype）、多态性信息量（polymorphism information content，PIC）；SSR 位点的多态性信息量PIC=1-∑Pi2，式中Pi表示第i个等位位点出现的频率；并根据Nei’s遗传距离[14]构建茶树品种的无根Neighbor-Joining（NJ）聚类图。

2 结果与分析

2.1 14个茶树品种的SSR多态性

10个EST-SSR标记在供试的茶树品种中均表现出多态性（表2）。其中PIC>0.5的有3个，变异范围在 0.173（TM283）～0.618（TM209），平均为 0.387，表明这些标记在参试材料中多态性适中；10个标记共检测到29个等位基因，等位基因数变异范围为2～4个，平均2.9个；有效等位基因数变异范围为 1.237（TM283）～3.143（TM209），平均 1.993 个；基因型最多的为 7个（TM209），最少的为 2个（TM136，TM283），平均 3.9 个；遗传多样性指数最高的为 TM209（1.213），最低的为 TM283（0.341）。

表2 10个茶树品种SSR标记的相关特征

2.2 茶树品种SSR标记等位基因的出现频率

29个等位基因在试验品种中的出现频率差异很大（表3）。TM283的等位基因2出现频率最高（89.29%）；其次为TM136的等位基因2（84.62%）和TM131的等位基因1（88.46%）。TM280的等位基因1出现频率最低（3.57%）；其次为TM131的等位基因2和TM215的等位基因3（均为3.85%）。对比表2和表3，可见出现频率较高的等位基因所对应的SSR标记其遗传多样性指数都较低。出现频率较低的等位基因所在的SSR标记分为两类：一类是标记的等位基因数较多的标记（TM209，TM211，TM280），另一类是等位基因数较少的标记（TM283）。

表3 SSR标记不同等位基因的出现频率

2.3 14个茶树品种的亲缘关系

根据10个SSR标记等位基因出现频率计算Nei’s遗传距离（D），结果显示14个茶树品种的遗传距离在0.036～0.472之间，其中南江1号和901的遗传距离最小，表明这两个品种间亲缘关系较近，而鄂茶5号和农抗早的遗传距离最大，说明这两品种亲缘关系最远。基于Nei’s遗传距离，采用NJ法构建品种聚类图（图1）。当D=0.12时，14个茶树品种可聚为三类；第一类包括4个品种，2个来自湖北（五峰212，五峰310），2个来自安徽（石佛翠，农抗早）；第二类包括2个安徽品种（901，石佛香）和1个重庆品种（南江1号）；第三类包括7个品种，其中2个湖北品种（鄂茶5号，鄂茶6号），3个福建品种（茗科3号，茗科4号，早玫瑰），1个四川品种（名山特早芽）和1个江西品种（大叶龙）。

表4 基于SSR标记的14个茶树品种的DNA身份证编码

2.4 14个茶树品种的DNA指纹图谱

将每个品种经不同标记扩增获得的等位基因带型，按照固定标记顺序排列，串联组合成特异的带型编码，再转化为计算机可识别的DNA身份证编码，即该品种的分子指纹图谱。为了减少编码序号长度，通常在构建指纹图谱时只选用几个鉴别能力较强的标记。该研究中只需4个SSR标记（TM128，TM280，TM148，TM211）即可鉴定 14 个茶树品种。因此，将这4个标记作为构建指纹图谱的核心标记。按照上述标记编号对每个茶树品种的等位基因带型组合进行编码，获得13位数的DNA身份证编码（表4），依此构建14个茶品种的指纹图谱（图1）。结果显示，每个茶树品种都对应一个惟一的指纹图谱，可较为快速地辨别各个品种。

图1 基于SSR标记的14个茶树品种的NJ聚类图及DNA指纹图谱

3 讨论与结论

3.1 茶树品种SSR标记等位基因变异

理论上参试品种越多，标记检测到的等位基因数就越多。乔婷婷[9]研究表明，其试验选用的10个SSR标记在308份茶树资源中检测到的等位基因数变异为 3（TM131，TM283）～8（TM211），平均为4.6，PIC只有 TM283小于 0.5，最高为 0.870（TM128），平均为0.677。而在该研究的14个茶树品种中检测到的等位基因数变异为2～4个，平均2.9个，其中9个标记（除TM131）检测到的等位基因数都少于之前的研究，只有3个标记（TM128，TM209，TM211）PIC 值 大 于 0.5， 最 高 为 0.618（TM209），最低为 0.173（TM283），平均为 0.387。这说明参试材料的不同，可能会造成标记检测效率差别较大。因此，在构建SSR指纹图谱库时应尽可能多地包含核心种植资源，以便获得更多的特异等位基因。

3.2 茶树品种SSR标记等位基因出现频率

该研究中等位基因出现频率变异范围为3.57%（TM280）～89.29%（TM283）。其中，出现频率较高的等位基因所在标记其遗传多样性指数都较低。而出现频率较低的等位基因所在的标记分为两类：一类是标记的等位基因数较多（TM209，TM211，TM280），但各等位基因出现频率较分散，使得其中某一个等位基因频率较低；另一类是等位基因数较少的标记（TM283），但其中某一个等位基因出现频率极高，而其他等位基因频率很低。对于这些在试验材料中出现频率很低的等位基因，可将其视为特异性等位基因（如TM131等位基因2，TM 209等位基因4，TM215等位基因3，TM280等位基因1），依此便可高效地鉴别具有该特异等位基因的材料，因此也适用于指纹图谱构建。

3.3 14个茶树品种的亲缘关系

研究结果表明，来自不同省份的14个茶树品种的Nei’s遗传距离在0.036～0.472之间，说明这些区试品种的亲缘关系较近。这可能是由于试验所用的14个品种均为选育的绿茶适制性品种，在遗传背景上可能较相近。基于遗传距离的NJ聚类图显示，当D=0.12时，14个茶树品种可聚为三类，来源相同的品种基本聚在一起。

3.4 茶树品种DNA指纹图谱的构建

标记的多态位点数对SSR分子标记的鉴别力有着重要的正向影响[15]。因此，在构建图谱时大多选择多态性较高的标记。该研究中利用4个SSR标记即可将14个茶树品种全部分开，并根据扩增的等位基因谱带组合类型将DNA多态性信息直接转化为计算机化的数字编码，然后绘制成可视化的条形码，结果显示每个品种都有唯一的指纹图谱，可以快速地对各品种进行鉴定。理论上，在利用SSR标记区分不同品种（二倍体）时，某一基因型的出现频率为2/（n+1）n（n为等位基因数），那么10个标记则可获得[（n+1）n/2]10个基因型组合类型。研究中10个SSR标记平均检测到2.9个等位基因，即理论上可区分3.3×107个品种。由此可见，利用SSR标记构建茶树指纹图谱进行品种鉴定具有极大的潜能和应用价值。随着茶树基因组测序的进行，可利用的SSR标记将大幅增加，构建覆盖整个茶树基因组的茶树指纹图谱库将成为可能，这对于茶树新品种的选育、鉴定、保护等具有重要意义。

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