8株方斑东风螺病原菌对17种中草药敏感性测定

贾春红,李淑芳,林红英,张继东

(广东海洋大学农学院,湛江524088)

细菌性疾病是水产动物养殖中最为常见危害较大的的一类疾病。国内已有副溶血弧菌、哈氏弧菌和创伤弧菌引起鱼、虾、贝等水产动物患病的报道[1]。腐败希瓦氏菌和海藻希瓦氏菌也可以引起水产动物发病，给养殖业造成经济损失。目前对上述疾病的防治仍主要依赖抗生素类药物，但关于希瓦氏菌属细菌引起疾病的防治报道较少。随着抗生素等抗菌药物的使用，一些副作用如耐药菌株的产生、药物残留、微生态平衡破坏、免疫系统受到抑制等已经显现[2]。因此，开发防治水产养殖中细菌性疾病的绿色制剂具有重要意义。为此，依据传统的中草药理论研究和实践，本项研究选取17种中草药对弧菌及希瓦氏菌地方菌株进行了单味药物及其两药配伍抑菌作用的研究，以期揭示其作用及相互影响，为应用中草药防治水产动物弧菌病和希瓦氏菌属细菌引起的细菌性疾病提供理论依据和参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试样品 猴耳环、桉叶、石榴皮等17种中药，购自湛江市某药店。

1.1.2 供试菌株及制备 副溶血性弧菌2株、哈氏弧菌1株、创伤弧菌1株、腐败希瓦氏菌1株、鲍鱼希瓦氏菌1株、海藻希瓦氏菌2株共8株，由广东海洋大学临床兽医实验室提供。经复壮、纯化后，接种到含3.5%NaCl的营养肉汤（pH7.8）中，35℃培养 18～24h，供试。

1.1.3 培养基 3.5%NaCl营养肉汤（pH7.8），3.5%Nacl营养琼脂（pH7.8），按常规制备。

1.2 试验方法

1.2.1 供试中草药的制备 采用煎煮法[3]。分别称取各种中草药各20g，加水200ml，浸泡30～60min，文火煎煮2次，每次30 min，然后过滤药液；将两次过滤药液合并，4000r/min离心10 min，浓缩至20mL，制备成浓度为1g/ml的水煎液，121℃高压灭菌20min，置4℃冰箱备用。

1.2.2 供试中草药药物敏感性测定 采用平皿打孔法[4]。用灭菌棉签蘸取菌液均匀涂布于含3.5%Nacl的营养琼脂（pH7.8）平板上，然后用直径6mm的打孔器均匀打洞，每皿4个，去除洞内琼脂后，将供试药液加于洞中，以满而不溢为宜，并作好标记，35℃恒温培养18～24h，观察结果，测定抑菌圈直径。重复3次，取平均值记录结果。结果判定，抑菌圈直径大于15mm为高度敏感，10～15mm为中度敏感，小于10mm为低度敏感。

1.2.3 中草药联合药敏试验 采用平皿打孔法[4]。根据上述药敏试验结果，选取供试菌株中度敏感以上的药物黄芩、石榴皮、苏木、乌梅、五倍子、大黄、地榆、连翘、秦皮、桉叶和猴耳环11种中草药进行联合药敏试验。具体操作同1.2.2。打孔根据中药药物敏感性测定试验结果确定两孔距离，然后加入相应的药液。根据抑菌图形，判断两药物间是具有协同作用，还是无关或拮抗作用[5]。

2 结果

2.1 供试中草药药物敏感性测定结果五倍子、乌梅、苏木、猴耳环对2株副溶血性弧菌、1株哈氏弧菌、1株创伤弧菌、1株腐败希瓦氏菌、1株鲍鱼希瓦氏菌、2株海藻希瓦氏菌8株菌呈高度敏感；大黄、地榆、桉叶对8株菌呈中度敏感；黄芩、石榴皮、连翘、秦皮4种中草药除分别对一株菌腐败希瓦氏菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、副溶血性弧菌1呈低度敏感外，对其余7株菌均呈中度敏感；石韦、鸭胆子、益智仁、郁金、板蓝根、贯众6种中草药除石韦对一株海藻希瓦氏菌呈中度敏感外，其余均未见抑菌作用。详见表1。

表1 供试中草药对各供试菌株的抑菌圈直径Tab.1 Results of drug sensitivity of Chinese herbal medicine for the test/mm

2.2 中草药联合药敏试验

五倍子与桉叶、乌梅与黄芩对药组对副溶血性弧菌1表现为协同；五倍子与黄芩、乌梅与黄芩对药组对副溶血性弧菌2表现为协同；乌梅与黄芩、地榆与秦皮对药组对哈氏弧菌表现为协同；乌梅与黄芩对药组对创伤弧菌表现为协同；乌梅与地榆、苏木与大黄、苏木与石榴皮对药组对腐败希瓦氏菌表现为协同；桉叶与黄芩、大黄与黄芩对药组对鲍鱼希瓦氏菌表现为协同；五倍子与秦皮对药组对海藻希瓦氏菌2表现为协同；其余均为相加。详见表2。

表2 供试中草药抑菌作用相互作用关系结果Tab.2 Results of associated drug sensitivity Chinese herbal medicine for the test

3 讨论

3.1 试验结果显示五倍子、乌梅、苏木、猴耳环4种中草药的水煎液对所选供试菌株的体外抑菌作用最好，呈高度敏感；石韦、鸭胆子、益智仁、郁金、板蓝根、贯众6种中草药抑菌作用较差或未见抑菌作用。五倍子、乌梅、苏木在弧菌病防治中的应用已多有记载和报道。王玉娥等[6]研究了5种海洋致病弧菌对34种中草药敏感性，结果发现乌梅、黄连、木瓜、五味子、五倍子对溶藻弧菌、哈氏弧菌、副溶血性弧菌、河流弧菌和麦氏弧菌均有很强的抑菌作用；梁利国等[7]在常用中草药对4种病原弧菌体外抗菌效果的研究中发现，五倍子、苏木、地锦草、石榴皮、黄芩、虎杖和山楂等7种中草药对鳗弧菌、副溶血弧菌、河口弧菌及霍乱弧菌等4种病原弧菌具有较好的抑菌效果；张晓君等[8]研究发现哈氏弧菌对地锦草、石韦、虎杖、苏木、大黄、穿心莲、黄芩、艾草、五倍子及桑叶高度敏感；童国忠等[9]研究发现石榴皮、乌梅、黄连等3种中草药对大黄鱼病原性哈氏弧菌菌株S030901菌株有明显的抑制作用，五味子、连翘、地榆、黄芩、蒲公英等5种呈微弱抑菌作用；李春远等[10]研究表明五倍子水提物对副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌和拟态弧菌呈较高的体外抗菌活性；本试验结果与这些研究结果一致，说明五倍子、乌梅、苏木的水煎液具有很好的抑制弧菌的作用，可用其防治这些细菌引起的疾病。本试验发现板蓝根对哈氏弧菌的抑菌作用与童国忠等[9]报道一致，与张晓君等[8]报道不一致，这可能与分离出来的菌株不一样有关，也可能与使用的板蓝根的产地不同有关。研究表明产地不同的板蓝根有效成分及含量，药理作用强弱等都存在差异[11]。本试验发现石韦对哈氏弧菌的抑菌作用与张晓君等[18]报道不一致，这可能与石韦的种或产地不同有关。李晓丹等[12]报道不同种石韦总黄酮含量存在显著差异；陈超君等[13]报道广西不同产地石韦的活性成分存在较大差异。

3.2 中药配伍是按照病情需要和药物的药理作用，将几味药合在一起组成复方用于临床。中药成分复杂，其治疗作用也往往是多方面的，一种中药当分别和不同的药物配伍使用时，可突出这种中药多效能中的某一效能而共同发挥治疗作用[14]。因此，了解中药之间的相互作用关系，具有很大的意义。本试验11种中草药的联合药敏试验结果显示，各药对对2株副溶血性弧菌、1株哈氏弧菌、1株创伤弧菌、1株腐败希瓦氏菌、1株鲍鱼希瓦氏菌、2株海藻希瓦氏菌8株菌相互用中，黄芩和乌梅对2株副溶血性弧菌，哈氏弧菌，创伤弧菌的相互作用都表现为协同；桉叶和五倍子对副溶血性弧菌1及秦皮与地榆对哈氏弧菌的相互作用也表现为协同；乌梅与地榆、苏木与大黄、苏木与石榴皮对药组对腐败希瓦氏菌表现为协同；桉叶与黄芩、大黄与黄芩对药组对鲍鱼希瓦氏菌表现为协同；五倍子与秦皮对药组对海藻希瓦氏菌2表现为协同；其余均表现为相加。说明各药物所含成分可能发生物理和化学的变化，使原有的某些成分发生转化或是产生新的化学成分[15]。因此，提示在选用中草药组织方剂时，要考虑药物有效成分相互间的影响。

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