复合膳食纤维对急性重症胰腺炎大鼠肠黏膜上皮紧密连接蛋白和肌球蛋白轻链激酶的影响

杨吉荣 王蕊娜 武 华

1.山西医科大学研究生学院，山西太原 030001；2.山东协和学院，山东济南 250100；3.山西医科大学附属第一医院普外科，山西太原 030001

重症急性胰腺炎（SAP）是临床上一种常见的急腹症，病 情险恶，死亡率高，不仅表现为胰腺局部的病理损伤，而且常常涉及明显的全身炎症反应及并发多器官损伤。肠屏障功能受损后引发的肠道细菌易位是其继发感染和脓毒症的主要原因[1]。研究证实多种细胞因子和炎性介质的释放是造成肠道屏障损伤、肠道通透性增加和肠源性感染的原因。复合膳食纤维（DFC）是不易被消化的食物营养素，能清肠通便，帮助消化，减轻受损肠黏膜的损害，改善肠黏膜的微生态，促进肠道功能的恢复，保护肠黏膜屏障。本实验通过建立大鼠重症急性胰腺炎模型，探讨复合膳食纤维（DFC）对肠屏障功能的影响，为临床应用提供依据。

1 资料与方法

1.1 动物与试剂

健康成年Wistar大鼠60只，雌雄各半，体重200～220 g。瑞素（肠内营养乳剂）、膳食纤维（包括可溶性和不可溶性膳食纤维）由华瑞制药有限公司提供。occludin、ZO-1以及肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的试剂盒由北京博奥森生物技术有限公司提供，DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物模型的建立

采用胰胆管逆行注射法复制SAP模型。Wistar大鼠造模前自由饮水，禁食24 h，腹腔内注射3%戊巴比妥钠溶液（0.1 mL/100 g）麻醉。采用腹部正中切口打开腹腔，近十二指肠乳头开口处用无创血管夹夹闭胰胆管，距左右肝管汇合处1 cm处用1 mL注射器穿刺胰胆管，并在该部位用无创血管钳夹闭胰胆管防止逆流，缓慢推注5%的牛黄胆酸钠（0.1mL/100 g）。远近端夹闭胰胆管10 min[2]。缝合十二指肠穿刺孔。可见胰腺组织充血、水肿，继而可见包膜下胰腺组织点状或小片状出血。空肠营养管：经胃幽门区，避开血管丰富区，先用粗针戳一破口，然后置入一外径1.5 mm硅胶管至空肠，于胃壁处缝合固定，经皮下隧道将其自颈部引出，固定于颈部皮肤后关腹[3]。术后随机抽样解剖证实为急性重症胰腺炎。

1.3 实验分组

将SAP大鼠随机分为三组：SAP+肠内营养乳剂 （瑞素）组（A组），SAP+瑞素加复合膳食纤维（20 g/L）1组（可溶性膳食纤维 SDF∶不可溶性膳食纤维 IDF=2∶1，B 组），SAP+瑞素加膳食纤维（20 g/L）2 组（SDF∶IDF=1∶2，C 组）。 术后 6 h 开始给予肠内营养，通过注射器按125 mL/（kg·d）分四次给予不同的肠内营养制剂。每组20只，饲养期间自由饮用生理盐水。

1.4 检测指标

于术后48 h每组20只大鼠开腹，距回盲部5 cm处取小肠组织10 cm，并与取材后采用颈椎脱臼法处死相应大鼠。所取小肠组织用10%甲醛溶液固定并制成石蜡切片。

1.4.1 小肠组织损伤评估 参考Chiu评分法评估小肠肠黏膜损伤程度[4]。行苏木精-伊红染色采用双盲法在光镜下观察组织损伤程度。

1.4.2 oc cl udi n、ZO-1与MLCK的表达 采用常规SP法测定后DAB显色，实验步骤按试剂盒说明书进行，阴性对照用磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗，同法进行染色。滴入occludin抗体（1∶200），ZO-1 抗体（1∶200），MLCK 抗体（1∶1 000），每一种切片随机选却染色清晰者5～8张，于光镜下（40×）随机选取3个视野，并在高倍镜下（200×）观察阳性颗粒在细胞内的分布。免疫染色的结果判断：一个半定量模式，由两个独立的无临床知识的观察者进行染色评分。细胞中出现棕褐色颗粒为阳性。＞75%的细胞染色判为（+++），51%～75%染色为（++），10%～50%染色为（+），＜10%染色为阴性[5]。所有实验均重复3次，以保证可重复性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行统计学分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，多组间的比较采用方差分析，两两比较采用q检验；计数资料采用精确概率法，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠内营养支持治疗后三组大鼠小肠组织损伤评分比较

B组与C组大鼠的肠黏膜损伤相对于A组较轻，C组大鼠的肠黏膜损伤相对于B组较轻，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。肠内营养支持治疗后三组大鼠小肠组织损伤评分比较见表1。

表1 肠内营养支持治疗后三组大鼠肠黏膜病理Chiu评分（x±s，分）

2.2 三组小肠黏膜occludin、ZO-1、MLCK蛋白的表达

肠内营养支持治疗的B组与C组大鼠的肠黏膜紧密连接蛋白occludin、ZO-1和MLCK的分布表达相对于A组增高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），且C组occludin及ZO-1的分布和表达高于B组（P＜0.05）。C组MLCK的分布和表达高于B组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2～4。

表2 小肠黏膜occludin蛋白的表达（例）

表3 小肠黏膜ZO-1蛋白的表达（例）

表4 小肠黏膜 MLCK蛋白的表达（例）

3 讨论

肠道上皮细胞的紧密连接状况直接反映其屏障功能。细胞紧密连接蛋白主要存在于上皮细胞、内皮细胞间的连接复合体中，使相邻细胞膜紧密靠在一起，形成环绕细胞的物理屏障结构。闭锁蛋白occludin是封闭相邻上皮细胞、内皮细胞之间间隙的重要成分，与质膜下蛋白密切相关共同维护紧密连接的屏障功能。ZO-1起着TJ形成的装配平台作用，它将闭锁蛋白和细胞骨架系统连接在一起，构成稳定的连接系统[6]。MLCK属于Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶家族，在Ca2+和钙调蛋白存在下，MLCK对肌球蛋白轻链（myosin light chain，MLC）进行磷酸化作用，并促进肌球蛋白与肌动蛋白丝间相互作用[7]，诱导连接周围的肌动蛋白和肌球蛋白丝收缩，对紧密连接和细胞表面产生张力，开放紧密连接[8]。通过使用肌动蛋白解聚剂能开放细胞间紧密连接[9]。在MLCK与肠黏膜屏障关系的研究中发现，由肌球蛋白Ⅱ调控的轻链的磷酸化引起的细胞骨架的收缩是肠上皮屏障破坏的必要因素[10]。

膳食纤维（DF）是指来源于植物，不被小肠中消化酶水解的多糖和极少量木质素的总和，主要为纤维素、半纤维素与果胶类物质，包括可溶性膳食纤维（SDF）和不可溶性膳食纤维 （IDF），SDF在上段肠腔不被消化吸收并在结肠被分解为短链脂肪酸（SCAF），可防止腹泻，维持和刺激肠道细胞的形态和功能。IDF具有促进肠蠕动，减少有毒物质与肠黏膜的接触时间，减少蛋白发酵产生毒物。二者共同保护肠黏膜屏障。本实验表明，含膳食纤维的瑞素肠内营养组较单纯瑞素肠内营养组肠黏膜病理改变轻，occludin、ZO-1以及肌球蛋白轻链激酶（MLCK）的表达较高，更有利于保护肠黏膜。还可以得出，适当的增加复合膳食纤维（DFC）中IDF的比例，更能减轻肠黏膜损伤，有利于紧密连接蛋白和细胞骨架的修复，保护肠黏膜屏障。但是目前尚无统一的标准。

综上所述，适当增加IDF可促进肠黏膜的修复，对临床肠内营养制剂的使用有一定的指导作用。

[1]黎介寿.肠衰竭——概念、营养支持与肠粘膜屏障维护[J].肠内与肠外营养，2004，11（2）：65-67.

[2]刘红山，潘承恩.大鼠重症急性胰腺炎肺泡巨噬细胞的火花和调控作用[J].中华实验外科杂志，2009，11（11）：1483-1485.

[3]周浩栋，蒋旭敏.膳食纤维肠内营养对大鼠急性重症胰腺炎肠粘膜屏障的影响[J].肝胆胰外科杂志，2007，1（1）：27-30.

[4]Chiu CJ，McArdle AH，Brown R，et al.Intestinal mucosal lesion in lowflow states.I.Amorphological，hemodyamic，and metabolic reappraisal[J].Arch Surg，1970，101（4）：478-483.

[5]陈振勇，冯贤松，周有生.梗阻性黄疸大鼠肠粘膜上皮紧密连接蛋白和 MLCK 的研究[J].中国普通外科杂志，2008，2（2）：140-144.

[6]杜勇.先天性巨结肠肠粘膜紧密连接蛋白分布表达方式的研究[J].临床儿科杂志，2006，24（5）：410-413.

[7]Patrick O，Angela T，Cecile，et al.Deletion of MLCK 210 induces subtle changes in vascular reactivity but does not affect cardiac function[J].Am JPhysiol Heart Circ Physiol，2005，289（6）：H2342-H2349.

[8]Fabeha F，lianzhi G，Ivanna I，et al.Inhibiting myosin light chain kinase induces apoptosis in vitro and in vivo[J].Mol Cel Biol，2005，25（14）：6259-6266.

[9]Madara JL.Relationships between the tight junctions and the eytoskeleton[M].M Cerreijido：CRC，1992：105-120.

[10]Wang F，Graham WV，Wang Y，et al.Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression[J].Am JPathol，2005，166（2）：409-419.