宫颈癌组织中HPV16型E6/E7序列突变分析＊

张志珊，庄建良，李爱禄，蒋燕成

宫颈癌与人类乳头状瘤病毒（HPV）的感染密切相关。HPV属于性传播疾病病原体，目前已鉴定出100多种基因亚型，其中至少有40个类型的HPV可以感染生殖部位，根据其致癌能力的大小分为高危型、中间型和低危型两种，高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、43、51、52、56、58、59、68、73、82等型，高危型HPV持续感染是激发宫颈上皮恶性转化的最重要危险因素，是宫颈癌及癌前病变发生发展的必要条件［1］。

HPV的基因约长8kb，主要由早期基因（E区）、晚期基因（L区）和长控制区（LCR）组成，E区有6个开放读框（ORF），编码6个早期蛋白，即El－E7。其中E6、E7基因在细胞癌变中起重要作用。在持续感染高危型HPV病毒后，病毒基因组会整合到宿主染色体中，E6和E7基因的表达调控也受到干扰。E6、E7基因特定位点的突变会使病毒更易诱导细胞产生癌变，增大再次感染或从宿主免疫系统逃逸的机会。本文对本自泉州地区的宫颈癌组织中HPV16型的E6、E7基因的序列进行分析，探索HPV16型E6、E7基因突变情况及其与宫颈癌发生的相关性，这对于宫颈癌的防治及指导疫苗设计具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 标本来源及DNA的提取 35例宫颈癌组织来自2009年1月－2010年12月本院妇产科宫颈癌术后样本（经病理检查确诊），这35例标本在前期实验中，通过对HPV亚型进行分型检测后，确定为HPV16型感染。全基因组DNA的提取采用QIAGEN公司的DNA mini kit。

1.2 PCR引物的设计与合成 根据GenBank公布的 HPV16序列（EU918764），应用 Premier 5.0软件设计两对引物分别用于扩增E6、E7基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物如下：

1.3 PCR扩增 引物E6F/E6R用于扩增E6基因，E7F/E7R用于扩增E7基因。反应体系为：10×buffer 5μL，dNTP 4μL，上、下游引物（20μmmol/L）各1μL，Ex Taq酶2.5U，模板1μL，加H2O至50μL。循环条件：95℃预变性5min，95℃30s，55℃30s，72℃30s，35个循环，72℃ 延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，送上海生物工程有限公司进行测序。

1.4 序列分析 测得的序列用Sequencher软件进行编辑、校正后，使用ClustalX和BioEdit进行基因的比对和多态性分析。

2 结 果

2.1 HPV16E6基因变异分析 35例样本的E6基因均成功扩增并测序。将测序结果与HPV16型的野生株（德国标准株，基因号K02718）［2］进行对比分析，结果发现35例样本中有32例存在基因突变，突变率为91.4%。共涉及到12个位点的14种不同突变模式，其中10个位点的变异为错义突变，另外2个位点为无义突变（A131C和T241G）。突变频率最高的是178位点，35例样本中有26例由原来的T突变为G，1例突变为A，结果均导致氨基酸的转换D25E（77.1%）。其它位点突变导致的氨基酸转 换 有 E113D，L83V，L28V，S138C，T21S，R144T，S142T，Q20P，T21I，R10G。突变频率的分布见表1，E6氨基酸序列比对见图1。

表1 HPV16E6基因变异分析Tab.1 Sequence variation of HPV 16E6in cervical cancer tissue

图1 HPV16E6蛋白氨基酸序列比对Fig.1 Alignment of amino acid sequences of HPV 16E6

2.2 HPV16E7基因变异分析 35例样本中，成功测序的有28例。通过对E7基因进行比对后，共发现5个突变位点，突变位点的数量低于E6基因，突变频率与E6基因接近（89.2%）。氨基酸比对结果显示，有2个位点为错义突变，3个位点为无义突变（图2）。28例样本中有21例发生A647G突变，导致氨基酸的转换（N29S），是突变频率最高的位点（75.0%）。另有1例发生L28F的氨基酸转换。在无义突变中，突变频率从高到低分别为T846C（75.0%）、G666A（32.1%），T843C（21.4%）。突变频率分布见表2。

表2 HPV16E7基因变异分析Tab.2 Sequence variation of HPV 16E7in cervical cancer tissue

3 讨 论

HPV感染是宫颈癌的首要病因，在全世界范围内，最常见的感染亚型是HPV16型。不同的HPV16变异株具有不同的生物学活性和致癌潜能，其中某些位点的变异与宫颈癌的发生密切相关［3－4］。来自世界范围的分子流行病学资料显示，E6基因的突变增强了致癌的危险性，同时这些突变株的致癌能力具有地域性［5］，Yamada等人曾报道在欧洲宫颈癌患者中，野生型E6基因（德国株）的分布频率为34%［6］，随后Zehbe等人报道，在瑞士宫颈癌患者中野生型E6基因的分布频率仅为6%［3］，与Pillai等人报道的印度人群中9.1%的流行率接近［7］。本次研究结果显示，35例宫颈癌患者中，有3例为野生型E6基因，仅占7.9%。在所有的E6突变位点中，报道最多的突变是T350G，不同的地域的分布频率差别较大，从2%～93.5%不等［6，8－11］。此位点的变异导致E6蛋白L83V氨基酸转换，使其对鳞状上皮和腺上皮细胞生长转化能力增强［4］，与宫颈上皮内瘤样病变Ⅰ级向Ⅲ级转化有关［12］。而来自德国和俄罗斯的报道则认为L83V变异与侵润性癌无关［13－14］。本次研究发现，泉州地区 HPV16E6基因L83V变异仅有3例，占7.9%，频率最高的突变是D25E，占77.1%，其次为E113D，占11.4%。其它变异还有 L28V，S138C，T21S，R144T，S142T，Q20P，T21I，R10G。我们发现D25E变异在泉州地区宫颈癌患者中最为流行，这与以往 Wu Y［10］等人报道的65.5%，Kang［15］报道的85.2%接近。该变异在东亚人种的分布频率高显著高于其它地区，被认为是亚洲型尤其是东亚病毒分枝的特异性变异。此次研究还发现了一些以往没有报道过的变异，如T21S，Q20P，T21I，R10G，其变异的频率较低，与宫颈癌的相关性有待于进一步探讨。

本研究显示泉州地区宫颈癌患者中HPV16E7基因也存在高频率的突变（89.2%）。与E6变异位点相比，本次研究中E7的变异位点相对较少，仅发现5个位点突变。只存在2种类型的错义突变N29S和L28F，其余3种均为无义突变。突变频率最高的是A647G突变（导致N29S氨基酸转换）和T846C（无义突变），突变率均为75.0%，与 Wu Y报道的70.2%和67.1%相近［10］。在以往报道中，A647G和T846C是最常见的2种变异，但是突变的频率差别较大。对于N29S的突变率，泰国宫颈癌患者为63.0%［16］，韩国为59.5%［17］，德国仅为0.9%［13］。这些资料显示，N29S突变主要存在亚洲人群，而较少发生在欧洲人群中，提示E7变异具有明显的地域性。研究还发现A647G和T846C这2种突变都是同时存在同一个样本中。这个结果和熊光武［18］等人的报道一致，可能提示这是中国人群中特异的突变类型，对于研究针对中国人群的HPV疫苗提供一定的线索。

图2 HPV16E7蛋白氨基酸序列比对Fig.2 Alignment of amino acid sequences of HPV 16E7

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