黄芩苷及三七总皂苷配伍脑脊液药代动力学研究

杨雁芳，李 智，王 磊，王永炎，张文生

(1.北京师范大学地表过程与资源生态国家重点实验室，北京 100875;2.北京大学药学院，北京 100191;3.中药资源保护与利用北京市重点实验室，北京 100875;4.天然药物教育部工程研究中心，北京 100875)

黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分，具有解热［1］、抗炎［2］、抗氧化［3］、免疫调节［4］等作用，近年来文献报道具有保护脑缺血/再灌注损伤［5－7］、保护神经细胞等作用［8－9］。三七总皂苷是中药三七的主要活性物质，具有较强的活血祛瘀、通经活络作用。“毒损脑络”是王永炎院士提出的中医脑病病机理论［10］，黄芩和三七是解毒法和通络法治疗脑病的常用药物，黄芩苷和三七总皂苷是其主要有效成分，在脑内的代谢过程决定着药效发挥。本文采用HPLCMS/MS法测定静脉注射给药后黄芩苷在大鼠脑脊液的分布，同时研究了三七总皂苷配伍对黄芩苷在大鼠脑脊液中分布的影响。

1 材料

1.1药品与试剂黄芩苷提取物(山东省诸城市浩天药业有限公司，批号YZ20090307，经HPLC测定黄芩苷含量为0.92);三七总皂苷(购自云南云科药业有限公司，经HPLC测定含人参皂苷Rb10.31、人参皂苷Rg10.32、三七皂苷R10.05);黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号110715-200815，含量0.95);卡马西平对照品(中国药品生物制品检定所，批号100142-201004，含量0.99);乙腈(色谱纯，美国 J.T.Backer)，甲醇、乙酸铵、甲酸、氨水(分析纯，北京化工厂)。

1.2仪器3200 Q TRAP质谱仪(Analyst 1.4.2数据处理软件，美国Applied Biosystem公司);Agilent 1100液相色谱仪(美国Agilent公司)。

1.3动物Wistar大鼠，♂，体质量180～200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验前禁食过夜，饮水不限。

2 方法

2.1药品配制精密称取黄芩苷提取物8 g，加入生理盐水200 ml，并用NaOH溶液调节pH至7.5，使黄芩苷充分溶解，得到40 g·L－1的黄芩苷溶液。精密称取黄芩苷提取物8 g，三七总皂苷10.4 g，同上法配制得到黄芩苷40 g·L－1、三七总皂苷52 g·L－1的配伍溶液。配制药品置4℃冰箱保存备用。

2.2给药与采样取健康清洁级Wistar大鼠80只，随机分成黄芩苷单独给药组(BA)和黄芩苷－三七总皂苷合并给药组(BA-PNS)，每组40只大鼠。将每个给药组的大鼠随机分成8个时间点，每个时间点5只。按黄芩苷100 mg·kg－1、三七总皂苷130 mg·kg－1的剂量尾静脉注射分别给予黄芩苷溶液和黄芩苷三七总皂苷配伍溶液。

分别在给药后不同时间点(5、15、30、60、120、240、360、480 min)将大鼠麻醉(按 6.7 ml·kg－1的剂量腹腔注射质量分数为1%的戊巴比妥钠溶液)并俯卧，剪开大鼠头颈部背侧皮肤，钝性剥离覆盖在枕骨上的肌肉，充分暴露环枕膜，将连有PE管的针头刺入枕骨大孔，PE管的另一侧用100 μl微量注射器缓慢抽取，可见有澄清的脑脊液被缓缓抽出，后段如有血液则弃去不用。将脑脊液样品置－80℃冰箱保存备用。

2.3脑脊液样品预处理取大鼠脑脊液20 μl，加入 1 mg·L－1卡马西平溶液4 μl，加入甲醇56 μl，涡旋振荡1 min，14 000 r·min－1离心10 min 后取上清液，进样。

2.4分析方法液相条件:色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流动相:A 为乙腈，B 为1 mmol·L－1乙酸铵(含 0.1% 甲酸)，C 为0.1%氨水，梯度洗脱程序见Tab 1;流速:1.0 ml·min－1;进样量:20 μl;柱温:25℃。

质谱条件:多反应监测(MRM);电喷雾离子源;离子模式:正负离子切换，0.00～3.71 min，黄芩苷［M －1］－(445/269)，离子源电压 －4 500 V，解簇电压－45 V;3.71～6.50 min，卡马西平［M+1］+(237/194)，离子源电压5 500 V，解簇电压70 V。

Tab 1 Gradient program of determination of baicalin in rat brain by HPLC-MS

2.5质控样品的制备取空白脑脊液20 μl，加入1 mg·L－1卡马西平溶液4 μl和一定体积的黄芩苷溶液(黄芩苷的终浓度依次为 10、100、160 μg·L－1)，加入甲醇补足至80 μl，余按“2.3 脑脊液样品预处理”方法操作后进样。

2.6标准曲线绘制取空白脑脊液20 μl，加入1 mg·L－1卡马西平溶液4 μl和一定体积的黄芩苷溶液(黄芩苷的终浓度依次为 5、10、30、100、200 μg·L-1)，加入甲醇补足至80 μl，余按“2.3脑脊液样品预处理”方法操作后进样测定。以黄芩苷和卡马西平的色谱峰峰面积比值Y为纵坐标，对照品浓度X(μg·L－1)为横坐标进行线性回归。

2.7含药脑脊液样品测定黄芩苷单独给药组和黄芩苷－三七总皂苷合并给药组的大鼠脑脊液样品的处理方法同“2.3”。样品测定方法同“2.4”。

2.8数据处理实验数据用 DAS 2.0版药动学软件拟合计算各项药动学参数。

3 结果

3.1方法专属性在采用的色谱和质谱条件下，黄芩苷和内标卡马西平的全扫描质谱见Fig 1，样品测定结果见Fig 2。黄芩苷和内标卡马西平分离良好，脑脊液中的内源性物质不干扰黄芩苷和内标物卡马西平的测定。

Fig 1 Full-scan mass of baicalin and carbamazepine(IS)

3.2标准曲线与线性范围大鼠脑脊液中黄芩苷的标准曲线:Y=2.84e－0.05X+0.000193(r=0.9905)，线性范围为 5 ～ 200 μg·L－1。最低定量限为 5 μg·L－1。

3.3回收率实验取低、中、高3个浓度的质控样品进行测定，每个浓度平行操作3份，用工作曲线计算浓度，以实际浓度为对照，计算回收率，见Tab 2。黄芩苷在脑脊液中的回收率在87.15%～92.73%范围内。

Fig 2 MRM of baicalin and Carbamazepine(IS)in rat CSF determination by HPLC-MS

3.4精密度实验取低、中、高3个浓度的质控样品进行测定。每个浓度的样品连续进样3次，计算相对标准差RSD，测定日内精密度。每个浓度的样品连续3 d，每天进样，测定日间精密度。结果见Tab 2。脑脊液中黄芩苷的日内和日间精密度RSD均小于5%。

Tab 2 Recovery and precision of baicalin in rat CSF(±s，n=3)

Tab 2 Recovery and precision of baicalin in rat CSF(±s，n=3)

Added/μg·L －1 RSD/%10 9.27 ±0.74 92.73 ±7.41 7.98 9.97 ±0.11 1.06 9 Recovery Determined/μg·L －1Recovery/% RSD/%Intra-day precision Determined/μg·L－1RSD/%Inter-day precision Determined/μg·L －1.57 ±0.45 4.75 100 90.70 ±5.34 87.34 ±3.27 3.75 96.05 ±0.72 0.75 92.50 ±2.63 2.84 160 139.31 ±4.16 87.15 ±2.52 2.89 145.33 ±1.531.05 143.33 ±5.03 3.51

3.5稳定性实验将低、中、高3个浓度的质控样品置于4℃冰箱中放置72 h，每24 h测定1次，测定结果RSD为2.00% ～4.78%，表明该保存条件下黄芩苷稳定性良好。

3.6实验组脑脊液样品中黄芩苷的药代动力学大鼠尾静脉注射黄芩苷以及黄芩苷－三七总皂苷配伍溶液后，黄芩苷在脑脊液中的分布浓度数据见Tab 3。脑脊液分布浓度－时间曲线见Fig 3。药代动力学参数见Tab 4。

Fig 3 Concentration-time curves of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Tab 3 Mean concentration of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Tab 3 Mean concentration of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Time/min BA/μg·L －1 BA+PNS/μg·L －1 189.33 ±20.60 237.06 ±51.86 15 134.90 ±42.74 64.80 ±34.19 30 23.17 ±11.75 22.70 ±13.17 60 13.01 ±6.35 12.22 ±8.09 120 10.38 ±2.62 11.11 ±1.34 240 7.06 ±1.60 4.65 ±1.30 360 3.89 ±2.20 2.00 ±1.79 5 480 1.04 ±1.51 0.83 ±0.97

Tab 4 Pharmacoknetic parameters of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Tab 4 Pharmacoknetic parameters of baicalin in rat CSF after intravenous administration(±s，n=5)

Parameters BA BA+PNS Tmax/min 55 Cmax/μg·L －1 189.67 ±20.13 237.00 ±51.86 AUC0-t/μg·min·L －1 6612.96 ±1023.65 5466.63 ±267.06 AUC0-∞ /μg·min·L－1 6930.43 ±1060.41 5682.13 ±412.79 T 12/min 108.84 ±45.67 102.54 ±38.37 Ke/min －1 0.0071 ±0.0027 0.0073 ±0.0023 CL/L·min－1·kg－115.39 ±2.60 18.32 ±0.88

4 讨论

文献有报道测定兔［11］和大鼠［12］脑脊液中黄芩苷含量的HPLC-MS方法，但在本实验中均未能达到很好的测定效果。本文建立的HPLC-MS-MS法测定条件可以将黄芩苷和内标卡马西平很好分离，且脑脊液中的内源性物质不干扰测定，方法学考察均符合要求。

不同文献对黄芩苷透过血脑屏障的能力有不同的结论。与上述文献建立了脑脊液中黄芩苷含量的测定方法不同，王冰［13］、Tsai等［14］认为黄芩苷不能透过血脑屏障进入脑脊液和脑组织，本课题组前期工作通过Discovery Studio软件预测认为黄芩苷透过血脑屏障的能力并不确定［15］，因此黄芩苷的脑脊液药代动力学研究很有意义。本实验结果证实，静脉注射黄芩苷后可以迅速进入大鼠脑脊液，且消除速度较快。

近年来中药的脑脊液药代动力学越来越受到重视，配伍对中药有效成分代谢的影响也成为一个新的研究方向。从本实验和三七总皂苷配伍前后黄芩苷的药代动力学参数来看，达峰时间Tmax均为5 min，峰浓度Cmax分别为(189.67±20.13)和(237.00±51.86)μg·L－1、曲线下面积 AUC0-t分别为(6612.96±1023.65)和(5466.63±267.06)μg·min·L－1、AUC0-∞分别为(6930.43 ± 1060.41)和(5682.13 ±412.79)μg·min·L－1、半衰期分别为(108.84±45.67)和(102.54±38.37)min、消除速率Ke分别为(0.0071±0.0027)和(0.0073±0.0023)min－1、清除率CL 分别为(15.39 ±2.60)和(18.32 ±0.88)L·min－1·kg－1，差异均无显著性，说明合用三七总皂苷后黄芩苷的脑脊液代谢无明显变化，证明三七总皂苷对黄芩苷进入脑脊液没有影响。但其他实验数据表明，三七总皂苷对黄芩苷的血液药代动力学和脑组织分布有明显影响(另文发表)，说明三七总皂苷通过影响黄芩苷体内的组织分布而改变其代谢过程，具有一定的临床指导意义。

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