白芍总苷对胶原性关节炎大鼠滑膜β抑制蛋白的影响与其抑制滑膜细胞增殖的关系

吴华勋，陈镜宇，汪庆童，孙妩弋，常 艳，吴育晶，张玲玲，魏 伟

(安徽医科大学临床药理研究所，抗炎免疫药理学教育部重点实验室，安徽省中药研究与开发重点实验室，抗炎免疫药物安徽省工程技术研究中心，安徽合肥 230032)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜炎症为主要病理表现的慢性、系统性、自身免疫性疾病［1］。白芍总苷(total glucosides of paeony，TGP)是从白芍干燥根中提取的有效部位，研究表明［2－3］，TGP可以抑制关节炎大鼠滑膜细胞增殖，调节免疫功能，在临床上治疗类风湿关节炎已经发挥了重要作用。滑膜炎的核心问题之一是滑膜细胞异常增殖，尽管对其的原因研究较多，涉及到多个细胞因子的作用以及 NF-κB、MAPKs信号的参与等，但G蛋白偶联信号在其中的作用较明显。研究发现，G蛋白-AC-cAMP信号通路介导了实验性关节炎大鼠滑膜细胞的异常增殖，TGP能明显抑制实验性关节炎大鼠滑膜组织中Gi的表达，促进Gs的表达，提高细胞内cAMP水平，从而降低滑膜细胞的增殖与分泌［4－6］。

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptors，GPCRs)是最大的膜蛋白家族，是重要的药物作用靶点，在炎症免疫应答中起着重要的信号转导作用［7］。β抑制蛋白分为β抑制蛋白1、2两种亚型，广泛存在于各种细胞中，调节绝大多数GPCRs的活性，促进GPCRs内化和脱敏［8］。其中β抑制蛋白1在胞质和胞核中都有表达，除参与GPCRs的调节，还可能通过核内功能调节自身免疫病;而β抑制蛋白2仅在胞质中表达，还参与了肿瘤坏死因子受体、TLR/IL-1R/RANK等信号通路的调节［9］。研究发现［10］，在胶原性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠滑膜组织中β抑制蛋白2表达在致炎后d 21、d 28明显增加，d 28达到峰值，与病程发展有相关性，可能与其影响G蛋白-cAMP信号通路发生异常改变有关。另有文献报道，采用β抑制蛋白2基因敲除小鼠，诱导造模，结果发现β抑制蛋白2基因敲除小鼠影响了关节炎的严重程度，这与其对滑膜细胞炎症的调整有关［11］。TGP对滑膜β抑制蛋白表达的影响是否与其抑制滑膜细胞增殖作用相关，未见文献报道。本文主要探讨TGP对CIA大鼠滑膜β抑制蛋白1、2表达的影响与其抑制滑膜细胞增殖的关系，旨在进一步揭示TGP治疗作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1动物Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量(120±20)g，♂，由安徽医科大学动物实验中心提供，合格证号:皖医实动准字第01号。

1.2药物与试剂TGP:棕色粉末，由亳白芍干燥根提取、纯化后得到;由安徽医科大学临床药理研究所化学室提供，给药时以质量浓度5 g·L－1羧甲基纤维素钠配制成所需浓度;雷公藤多苷(GTW)，上海复旦复华药业有限公司，实验时均以质量浓度5 g·L－1羧甲基纤维素钠配制成所需浓度;卡介苗(BCG):卫生部上海生物制品所产品，用前80℃灭活;鸡Ⅱ型胶原(CCⅡ):上海本草生物医学工程所;羊抗β抑制蛋白1抗体(K16，sc-9182):购于Santa Cruz公司;小鼠抗 β抑制蛋白2抗体 (H-9，sc-13140):购于Santa Cruz公司;辣根酶兔抗山羊IgG(H+L)，辣根酶山羊抗小鼠IgG(H+L)购于北京中杉公司;β-actin选购于Sigma公司;

1.3方法

1.3.1大鼠CIA模型的建立将 CCⅡ溶于0.1 mol·L－1的冰醋酸中，浓度为 0.4 g·L－1，将研钵置于冰袋上，研磨CCⅡ至充分溶解，置4℃冰箱过夜;再将80℃、1 h灭活的BCG溶于液体石蜡中，配成0.4 g·L－1的完全弗氏佐剂(CFA)，将二者等体积混合、乳化，制成CCⅡ乳剂(即每1 ml中含0.2 mg CCII)。将该乳剂于大鼠的足爪、背部、尾根部多点皮内注射致炎(1 ml/只)。注射致炎后d 7，再用上述CⅡ乳剂背、尾部皮内注射加强(1 ml/只)。正常组用生理盐水同法注射。

1.3.2实验分组和给药方案SD大鼠随机分为6组:正常对照组，CIA模型组，TGP低、中、高剂量组(25、50、100 mg·kg－1)和阳性对照组(GTW 40 mg·kg－1)。各用药组于致炎后d 14～28 ig给药，qd，正常对照组和CIA模型组ig等容量的5 g·L－1羧甲基纤维素钠。

1.3.3关节炎指数(arthritis index，AI)评分致炎后d 14、d 20、d 28观察并记录大鼠全身关节病变情况，每只足趾按下列标准评分:0分:正常;1分:踝关节出现红斑和轻微肿胀;2分:踝关节到趾关节或掌关节红斑和轻微肿胀;3分:踝关节到跖趾关节或掌关节红斑和中度肿胀;4分:踝关节到趾关节出现红斑和重度肿胀。未注射胶原的其余3个关节的评分累计之和即为每只大鼠的AI。

1.3.4滑膜细胞增殖反应的测定采用MTT法。体内给药各组大鼠滑膜细胞经培养后，制备细胞悬液(5 ×109cells·L－1)，加至96孔培养板，每孔100 μl，设6 个复孔，再加入 100 μl含 8 mg·L－1LPS 的DMEM培养液，置于37℃、5%CO2培养箱培养，培养72h，终止培养前4 h各孔加MTT(5 g·L－1)溶液20 μl继续培养，培养结束后弃去上清液，加入DMSO(100 μl/孔)，振荡3 min后于酶标仪490 nm波长处测吸光度(absorbance，A值)。以正常大鼠滑膜细胞为对照组，每组以6孔的均值表示其结果。

1.3.5β抑制蛋白表达的测定处死大鼠，取滑膜组织，提取蛋白行SDS-PAGE，转移至PVDF膜后，用质量浓度50 g·L－1脱脂牛奶室温封闭2 h;室温孵育一抗2 h，PBS洗3次，每次10min;室温孵育二抗2 h，PBS洗3次，每次10 min;ECL试剂盒显色。结果采用凝胶成像系统扫描后，以特异性条带浓度与面积的乘积为有效值，反映蛋白表达水平。

1.3.6统计学分析数据分析用SPSS17.0软件处理，数据以表示，组间比较采用t检验。

2 结果

2.1TGP对CIA大鼠关节炎足爪指数评分的影响致炎后d14，对CIA大鼠关节炎指数进行评分，CIA模型大鼠足爪分值不断升高，到d 28达高峰，与足爪肿胀时间一致。TGP(25、50、100 mg·kg－1，d 14 ～28)、GTW(40 mg·kg－1，d 14 ～28)连续灌胃给药14 d，可明显抑制CIA大鼠多发性关节炎评分分值(Tab 1)。

Tab 1 Influence of TGP on arthritis index in CIA rats(±s，n=9)

Tab 1 Influence of TGP on arthritis index in CIA rats(±s，n=9)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CIA group

Group Dose/mg·kg－1 Arthritis index d 20 d 24 d 28 CIA － 3.667 ±1.231 5.678 ±1.435 7.000 ±1.279 TGP 25 2.454 ±1.086* 3.300 ±1.712＊＊ 2.636 ±1.054＊＊50 2.300 ±0.948＊＊ 3.181 ±1.250＊＊ 2.600 ±1.776＊＊100 2.100 ±0.934＊＊ 2.600 ±1.577＊＊ 2.012 ±0.911＊＊GTW 40 2.500 ±1.080* 2.610 ±1.567＊＊ 2.512 ±1.269＊＊

2.2TGP体内用药对CIA大鼠FLS增殖反应的影响末次给药后分离大鼠滑膜组织，经胶原酶－胰蛋白酶消化法分离得到FLS，取第3代FLS，MTT法检测其增殖反应。结果表明，CIA大鼠FLS增殖反应增强，TGP(50、100 mg·kg－1，d 14 ～ 28)和GTW(40 mg·kg－1，d 14 ～28)可不同程度的抑制FLS增殖反应(Tab 2)。

Tab 2 Influence of TGP on synoviocyte proliferation in CIA rats(±s，n=6)

Tab 2 Influence of TGP on synoviocyte proliferation in CIA rats(±s，n=6)

#P＜0.05 vs normal;*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs CIA.

Group Dose/mg·kg－1 Synoviocyte proliferation(A)Normal － 0.110 ±0.020 CIA － 0.163 ±0.037#TGP 25 0.136 ±0.034 50 0.116 ±0.023*100 0.107 ±0.017＊＊GTW 40 0.112 ±0.020*

2.3TGP体内用药对滑膜组织β抑制蛋白表达的影响大鼠致炎后d 28处死，分离滑膜组织，用Western blot法检测滑膜组织中β抑制蛋白1、2表达水平。结果表明，与正常组相比，模型组β抑制蛋白2表达明显升高，β抑制蛋白1无明显变化;TGP(100 mg·kg－1)能明显减少致炎后β抑制蛋白2的表达，而对β抑制蛋白1表达无明显影响(Fig 1)。

Fig 1 Effects of TGP on expression of β-arrestins in synovial tissue of CIA rats(±s，n=4)

2.4TGP对CIA大鼠滑膜β抑制蛋白表达的影响与其抑制滑膜细胞增殖作用相关性分析TGP对β抑制蛋白1表达无影响，故主要分析TGP对CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表达的影响与其抑制滑膜细胞增殖作用的相关性。经相关性分析，TGP对CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表达的影响与其抑制滑膜细胞增殖作用呈高度相关(r=0.88)，随着TGP浓度的增加，其下调β抑制蛋白2表达的作用增强，抑制滑膜细胞增殖作用增加，逐渐趋于正常组的β抑制蛋白2表达水平及滑膜细胞增殖状态(Fig 2)。

3 讨论

G蛋白偶联信号转导通路的异常在炎症免疫性疾病进程中起重要作用［12］，其中GPCRs－G蛋白－cAMP信号通路参与多种生理活性的调节，包括对细胞增殖与分化的调节。细胞的异常增殖、快速分化等与细胞内的cAMP改变有关，cAMP水平增高可抑制细胞的增殖效应。

Fig 2 Correlation analysis between effects of TGP on expression of β-arrestin 2 and on synoviocyte proliferation(A)

β抑制蛋白是GPCR信号的负调控者，与G蛋白偶联受体激酶(G-protein-coupled receptors kinases，GRKs)协同促进GPCRs内化和脱敏。β抑制蛋白的功能变化将影响GPCRs介导的信号转导的效应［13］，从而可能影响 cAMP水平及细胞的增殖活性。另外，β抑制蛋白可通过调节 NF-κB、MAPKs信号通路参与许多炎症免疫性疾病的发病过程。

本实验研究发现，CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表达升高，TGP对CIA大鼠滑膜β抑制蛋白2表达的影响与其抑制滑膜细胞增殖作用呈高度相关。本课题组以往研究也发现，在CIA大鼠滑膜细胞中GRKs的表达在炎症高峰期上调，与病程发展有相关性［14］。根据相关实验结果，我们推断关节炎症期间，各种致炎细胞因子水平升高，长期或反复刺激后，可能引起β抑制蛋白2自身保护性的表达上调，以促进GPCRs与G蛋白脱偶联，从而关闭了一些通过GPCRs的信号通路，导致G蛋白-cAMP信号通路发生异常改变，cAMP水平下降。TGP能下调β抑制蛋白2的表达，降低其对GPCRs与G蛋白的脱偶联作用，恢复G蛋白-cAMP信号通路，从而发挥抑制滑膜细胞增殖，治疗关节炎的作用。

此外，在RA中NF-κB是明显活化的，它在RA炎症、骨质破坏、细胞的增殖、血管翳的形成中起重要作用，β抑制蛋白表达的上调可以明显抑制NF-κB活化;MAPKs在RA滑膜组织中表达升高，β抑制蛋白2可以作为支架蛋白，促进MAPKs通路的活化［10］;β抑制蛋白对这些通路的调整也可能参与了RA的发病过程，在下一步的工作中将进一步探讨。

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