知母皂苷对脂多糖引起星形胶质细胞炎症因子释放的影响及机制

刘 卓，隋海娟，闫恩志，刘婉珠，金 英

(辽宁医学院1.药理学教研室、2.机能实验中心，辽宁 锦州 121001)

星形胶质细胞(astrocyte，AC)是中枢神经系统内体积最大、分布最广泛的胶质细胞，对神经元起支持及分隔作用。同时，AC也是免疫活性细胞，能合成分泌多种神经递质、激素及神经营养因子，维持着神经元内外环境、免疫调节和信号转导等功能［1］。阿尔采末病 (Alzheimer’s disease，AD)的关键性特征之一是脑内炎症，炎症过程是由AC和小胶质细胞释放的细胞因子，如TNF-α和IL-1β，并产生其他细胞因子和神经毒性物质，其中一些炎症因子反过来诱导更多的胶质细胞趋化、活化，另一些则导致局部组织损伤，从而损害神经元。

知母为百合科植物知母的干燥根茎，其中知母皂苷(saponins from anemarrhena asphodeloides bge，SAaB)为知母的主要活性成分，在根茎中含约6%，且种类较多，作用广泛。研究表明SAaB能够明显抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的大鼠小胶质细胞的数目增多以及炎症因子IL-1β和NO的过度释放［2］，并且SAaB能对抗淀粉样β蛋白片段25-35引起小鼠腹腔巨噬细胞炎症细胞因子TNF-α和NO的分泌［3－4］，提示其有明显的抗炎作用。本研究采用LPS损伤模型，观察SAaB对培养的大鼠乳鼠皮质AC分泌TNF-α和NO的影响，并进一步探讨其调控c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)信号转导通路的表达而发挥抗炎效应的可能机制。

1 材料与方法

1.1药品和试剂SAaB由成都普瑞法科技开发有限公司提供，批号S08039，HPLC分析纯度＞98%，分子质量为416.64，临用时用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解。DMSO、LPS、DMEM、胰蛋白酶和L-多聚赖氨酸均购自Sigma公司;SP600125购于厦门励远有限公司;新生胎牛血清、HEPES、马血清购于北京华美转导科技有限公司;磷酸化ATF-2抗体(Thr69/71)、磷酸化 JNK1/2抗体(Thr183/Tyr185)和磷酸化c-Jun抗体(Ser63)购于Cell Signaling公司。TNF-α的ELISA试剂盒购于武汉博士德生物科技有限公司;NO检测Griess试剂盒购于碧云天生物技术研究所。

1.2大脑皮层AC的培养取出生1～2 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠，无菌条件下取出大脑皮层，剔除血管和软脑膜，剪碎后加入0.125%胰蛋白酶37℃消化。待细胞分散后，终止消化。200目筛网过滤、离心，用完全培养基制成细胞悬液，调整细胞密度为1 ×108～1 ×109cells·L－1，接种在75 cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。以后每3天换液1次，d 9将培养的AC置于水浴恒温振荡器上，37℃、260 r·min-1、18 h，舍弃含脱落细胞的细胞悬液，以去除少突胶质细胞和小胶质细胞，仍贴壁的细胞大部分为AC。用0.25%胰蛋白酶溶液消化后离心，完全培养基重悬，接种于两个75 cm2培养瓶中以传代。细胞传2～3代后进行实验。

1.3实验分组及给药方法取培养第2～3代AC接种于培养瓶或培养板，置于培养箱中培养3 d，待细胞增殖融合成单层，按加入药物不同分为①对照组:加入0.1%的DMSO;②LPS组:LPS用培养基新鲜配置，终浓度为10 mg·L－1，作用24 h;③ SAaB组:加入不同浓度的 SAaB 1、10、100 μmol·L－1作用1 h后再加入LPS继续作用24 h;④ SP600125组:加入 SP600125 10 μmol·L－1作用1 h 后再加入 LPS共同作用24 h或单独加SP600125作用24 h。

1.4ELISA法测定AC上清液中TNF-α含量AC传2-3代后进行分组，药物处理24 h后，收集细胞培养上清液，按TNF-α检测试剂盒说明书进行操作，在酶标仪上读取不同浓度TNF-α标准品相应的光密度值(A450)，绘制出标准曲线，得出直线回归方程。测定各组上清液的光密度值，并代入相应的直线回归方程中，计算出TNF-α的含量。

1.5Griess法测定AC培养上清液中NO含量AC传2～3代后进行分组给药，收集各组细胞培养上清液，1 500 r·min－1，4℃，离心 10 min，分装，－80℃冻存。以NO的稳定性代谢产物——亚硝酸盐作为检测 NO的指标，根据Griess法测定培养液中NO的含量。

1.6Western blot法检测磷酸化JNK、磷酸化c-Jun蛋白表达水平细胞经实验因素处理后，离心收集。放入预冷的裂解缓冲液中，4℃超声粉碎后，12 000×g离心30 min，取上清，用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。用10%～12%的SDS-PAGE分离蛋白质，电泳后将PAGE凝胶中的蛋白质电转移至PVDF膜上，取出后将膜放入3%BSA封闭液中，封闭60 min，再用TBST洗膜3次，每次10 min。将膜放入一抗中(1∶500)，4℃孵育过夜。TTBS冲洗后，将膜放入相应二抗(1∶1 000)中，室温孵育1～2 h，漂洗3次。将膜在SuperSignal West Pico底物工作液中孵育5 min，吸干多余试剂，放置化学发光凝胶系统分析仪中进行ECL化学发光，分析结果。以每个条带的Area Density测得值与其相对应的总蛋白的比值表示蛋白的表达水平。实验重复3次。

1.7免疫荧光染色法检测AC的ATF-2表达AC经药物处理后，移去培养基，用冷的PBS漂洗2次。4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS漂洗3次，每次10 min。0.3%Triton X-100作用30 min，PBS漂洗3次，每次10 min。3%山羊血清封闭30 min;加入磷酸化ATF-2抗体(1∶100)4℃过夜，PBS漂洗后，加入TRITC标记的二抗作用2 h，PBS漂洗。荧光倒置显微镜下观察，拍照。

1.8统计学处理实验结果数据用±s表示，采用one-way ANOVA和LSD’s post hoc test进行统计学分析。

2 结果

2.1SAaB对LPS诱导AC分泌TNF-α和NO的影响应用ELISA方法和Griess方法分别测定了AC培养液中TNF-α和NO的含量，结果表明LPS(10 mg·L－1)诱导后AC分泌TNF-α和NO明显增加，SAaB(1、10 和 100 μmol·L－1)可明显抑制由LPS诱导AC的TNF-α和NO的分泌。SP600125可对抗LPS诱导AC分泌TNF-α和NO增加，说明LPS诱导的TNF-α和NO产生增加与激活JNK信号转导通路有关，单独应用SP600125对AC正常分泌TNF-α和NO无明显作用(Tab 1)。

Tab 1 Effects of SAaB and SP600125 on LPS-induced release of TNF-α and NO in cultured medium of astrocytes(±s，n=6)

Tab 1 Effects of SAaB and SP600125 on LPS-induced release of TNF-α and NO in cultured medium of astrocytes(±s，n=6)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group

Group TNF-α/ng·L －1NO/μmol·L －1 Control 1.95 ±0.26 5.78 ±0.94 LPS 11.89 ±1.51＊＊ 16.44 ±1.79＊＊LPS+SAaB 1 μmol·L －1 9.86 ±1.12## 13.26 ±1.97#LPS+SAaB 10 μmol·L－1 5.99 ±1.39## 8.73 ±1.49##LPS+SAaB 100 μmol·L－1 3.45 ±0.68## 6.51 ±0.86##LPS+SP600125 10 μmol·L －1 4.23 ±0.41## 7.47 ±0.90##SP600125 10 μmol·L －12.15 ±0.32 5.37 ±0.68

2.2SAaB对AC磷酸化JNK和磷酸化c-Jun蛋白表达水平的影响Fig 1，2显示，LPS作用后，AC磷酸化JNK、c-Jun蛋白表达水平明显增加，SAaB(1、10 和100 μmol·L－1)可明显对抗 LPS 诱导 AC的磷酸化JNK和磷酸化c-Jun蛋白水平增加;但总量JNK(Total-JNK，T-JNK)和总量 c-Jun(Total-c-Jun，T-c-Jun)蛋白表达几乎没有改变。

2.3免疫荧光观察SAaB对LPS引起AC的磷酸化ATF-2表达水平的影响正常对照组AC内几乎没有染色，说明正常情况下AC的磷酸化ATF-2蛋白表达水平极低(Fig 3A);LPS刺激后荧光染色强度明显增加，说明AC的磷酸化ATF-2表达水平明显增加(Fig 3B)，SAaB(10 和100 μmol·L－1)能明显抑制LPS的作用，使磷酸化ATF-2表达水平明显降低(Fig 3C、3D)，SP600125(10 μmol·L-1)也可明显减少LPS引起AC的磷酸化ATF-2蛋白表达上调(Fig 3E)。

Fig 1 Effects of SAaB on LPS-induced phospho-JNK level in astrocytes in rats by Western blot

Fig 2 Effect of SAaB on the expression of phospho-c-Jun level in cultured astrocytes in rats by Western blot

3 讨论

Fig3 EffectofSAaB and SP600125 on activating transcription Factor-2(ATF-2)n cultured astrocytes in rats by immunostaining(×400)

在AD患者的脑内发现有明显的胶质细胞反应，老年斑周围有大量活化的AC包裹［5］。研究表明，在病理条件下AC从静息状态快速转化成活化状态，并且其活化具有瀑布效应，活化的AC可分泌大量的细胞炎症介质如IL-1β、IL-6及TNF-α等，这些物质对神经元有毒性作用，使神经元凋亡并坏死［6－7］。革兰阴性菌细胞壁的主要成分LPS可以刺激靶细胞直接分泌炎症因子，更重要的是可以通过信号转导作用，将胞外刺激转入细胞核内，进一步扩大和增强各种炎症因子的作用。现已证实JNK信号转导途径参与了炎症反应中星形胶质细胞活化的过程［8－9］，并在细胞炎症反应的病理过程中起着至关重要的作用。JNK又称SAPK，即应激活化蛋白激酶，是丝裂原活化的蛋白激酶家族之一，主要受炎性细胞因子和应激信号的激活引起应激反应，从而导致细胞生长停滞和凋亡。JNK一旦被激活，其双磷酸化功能区Thr-Pro-Tyr与c-Jun N端的活化区结合并使其第63、73位丝氨酸残基磷酸化从而使其活化并转移到细胞核，激活其下游c-Jun，引起级联反应［10－11］。c-Jun是细胞内的一个重要转录因子，细胞遭受凋亡刺激时c-Jun被上游激酶磷酸化激活，上调自身表达同时，活化的c-Jun必须与ATF-2［12］或c-Fos［13］形成复合物才能发挥转录活性。本实验结果中特异性JNK特异性阻断剂SP600125可对抗LPS诱导AC分泌炎症因子TNF-α和NO增加，并且LPS可引起磷酸化JNK、c-Jun以及ATF-2的蛋白表达水平增高，都说明LPS诱导炎症因子分泌的增加与激活JNK信号转导通路有关。

本研究通过LPS造成AC炎症模型，观察到SAaB能够明显减少LPS引起的炎症因子TNF-α和NO分泌增多，同时能下调LPS引起的磷酸化JNK、c-Jun和ATF-2蛋白表达水平，表明了SAaB对星形胶质细胞炎症反应有明显的抑制作用，并且该作用与其下调了JNK信号转导通路有关。已证实SAaB可通过上调脑胆碱能受体［14］、清除自由基、抑制小胶质细胞炎症、抗海马神经细胞凋亡以及增加海马突触相关蛋白的表达［15］等方面明显改善AD模型的学习记忆障碍，本实验通过SAaB抑制AC的炎症作用，为其治疗AD又提供了一条新途径。

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