毛木耳原生质体制备与再生条件的研究*

孙 露，姚方杰,2**，方 明

（1吉林农业大学园艺学院，长春 130118；2食药用菌教育部工程研究中心，长春 130118）

原生质体技术是为食用菌细胞生物工程育种提供了新技术，在食用菌育种中具有明显的开拓性[1、2]。在木耳属中大量栽培的有木耳和毛木耳2个种，但是有关原生质体的研究却多集中于栽培量最大的木耳上，而对产量仅次于木耳的毛木耳的研究却较少[3－6]。本试验对影响毛木耳原生质体制备与再生的若干条件进行研究，旨在建立起最佳的毛木耳原生质体制备、再生体系，为进一步开展毛木耳等木耳属食用菌的遗传育种研究提供技术支持。

1 供试菌株

供试菌株由吉林农业大学园艺学院提供 （由云南农科院采集于云南省西双版纳傣族自治州勐腊县内山区）。

2 试验方法

2.1 原生质体制备条件的优化

采用SMY液体培养基培养菌丝。

分别设置4个培养时间、4个酶解温度、5个酶解时间、5个融壁酶浓度、4种渗透压稳定剂及其4浓度进行原生质体制备条件的优化研究。

菌丝培养及原生质体制备参照木耳[4]。

2.2 原生质体再生条件 （培养基）的优化

设计3个配方筛选最佳再生培养基。即在基本配方（马铃薯 200g、 葡萄糖 20 g、 蛋白胨 2 g、 MgSO40.5 g、K2HPO41 g、 KH2PO40.46 g、 VB110 mg、 琼脂 15 g/8 g、 水1 000 mL）内加入 0.5M MgSO4的为 RM1 （MgSO4）， 0.5M甘露醇的为RM2（甘露），0.5M蔗糖RM3（蔗糖）。

3 结果与分析

3.1 出发菌龄

菌株的生理状态是影响其原生质体化的内在因素，其中菌龄对原生质体制备的影响尤为明显。本试验选择培养4 d~7 d的幼龄菌丝体进行试验，制得原生质体数量由多到少顺序为5 d＞6 d＞4 d＞7 d，如图1。毛木耳菌株培养5 d时原生质体产量最大达到1.0×107个·ml-1。

图1 不同菌龄制得原生质体数量Figure 1 Protoplast number of different cell ages

3.2 融壁酶浓度

根据不同的食用菌种类及细胞壁成分应选择相应的融壁酶。本试验选用广东微生物所产的融壁酶，制备效果较好。如图2，原生质体数量由多到少顺序为1.5%＞2%＞1%＞2.5%＞3%。融壁酶浓度为1.5%时原生质体产量最大达到1.11×107个·mL-1。随着酶浓度的增大，原生质体产量有先上升后下降的趋势。因此，毛木耳原生质体制备的最佳的酶浓度为1.5%。

图2 不同融壁酶浓度制得原生质体数量Figure 2 Protoplast number of different enzyme concentration

3.3 酶解温度及酶解时间

酶解温度和酶解时间是影响原生质体产量的两个重要因素。本试验选择25℃、30℃、35℃、40℃四个温度进行试验，原生质体产量如图3。随着酶解温度的升高，原生质体产量呈现先上升后下降的趋势，在30℃时原生质体产量达到最大值 1.04×107个·mL-1。

不同酶解的时间，会有不同的位置发生酶解，因此所得到的原生质体产量及生理活性也不一样,如图4。随着酶解时间的延长，原生质体产量也呈现先上升后下降的趋势，酶解3 h时原生质体产量达到最大值9.6×106个·mL-1。酶解时间再延长反而会导致原生质体产量的下降。因此，毛木耳原生质体制备的最佳酶解温度为30℃，酶解时间为3 h。

3.4 渗透压稳定剂种类及浓度

图3 不同酶解温度制得原生质体数量Figure 3 Protoplast number of different enzymatic hydrolysis tem perature

图4 不同酶解时间制得原生质体数量Figure 4 Protoplast number of different enzymatic hydrolysis time

图5 不同渗透压稳定剂制得原生质体数量Figure 5 Protoplast number of different osmotic stabilizer

图6 不同渗透压稳定剂浓度制得原生质体数量Figure 6 Protoplast number of different osmotic stabilizer concen tration

由图5、图6看出，利用不同渗透压稳定剂制得的原生质体数量由多到少为甘露醇＞MgSO4＞蔗糖＞KCl。甘露醇作为渗透压稳定剂，浓度为0.5 M时原生质体产量高达1.02×107个·mL－1。 图 7 为供试菌株在最佳原生质体制备条件下得到的原生质体。

图7 毛木耳原生质体 (40倍)Figure 7 Protoplasts of Auricularia polytricha (40 times)

3.5 再生培养基类型

在三种再生培养基中，RM1（MgSO4）的再生菌落极少，再生率几乎为0；RM2（甘露醇）的再生菌落较多，再生率为0.196%；RM3（蔗糖）的再生菌落最多 （如图8），再生率为1.144%。因此，RM3为毛木耳原生质体的最佳再生培养基。

4 讨论与结论

本试验结果表明，毛木耳原生质体制备的最佳条件：菌龄5d；融壁酶浓度为1.5%，酶解温度30℃，酶解时间3h；渗透压稳定剂选择甘露醇，浓度为0.5 M。在最佳酶解条件下， 原生质体数量可达到 1.1×107个·mL－1。

最适再生培养基配方为：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋 白 胨 2 g， MgSO40.5 g， K2HPO41 g， KH2PO40.46 g，VB110 mg， 琼脂 15g/8 g， 0.5M 蔗糖,水 1 000 mL。

图8 原生质体再生菌落Figure 8 Protoplast regeneration

但是，与其它食用菌相比，毛木耳原生质体的再生率较低，在最佳制备及再生条件下仅为1.144%。这可能是由于毛木耳菌丝生长速度较慢造成的。有研究表明，食用菌原生质体再生率与其生长速度成正相关，生长速度慢的再生率也低，受其自身的遗传特性的影响

[1]刘祖同，罗信昌.食用蕈菌生物技术及应用[M].北京：清华大学出版社，2002.

[2]李守勉，李明，刑蕾，等.食用菌原生质体技术应用的研究 [J].安徽农业科 2007， 35(25):7770－7771.

[3]姚方杰，张友民，陈影.我国黑木耳产业发展形势 [J].北方园艺,2010， 18:209－211.

[4]罗信昌.光木耳和毛木耳原生质体的形成和再生 [J].华中农业大学学报， 1987， 6(2):189－191.

[5]韩增华，张丕奇，戴肖东，等.黑木耳原生质体制备、再生及单核体荧光鉴定[J].食用菌学报， 2008， 15(3):13－17.

[6]李楠，许修宏.黑木耳原生质体制备及再生的研究 [J].东北农业大学学报， 2009， 40(7):34－37.