溶液Ca、K浓度和pH对烟草Cd毒性的影响

雷丽萍，陈世宝，孙 聪，徐照丽，汪安云，柴家荣

（1.云南省烟草农业科学研究院，云南 玉溪 653100；2.农业部植物营养与施肥重点实验室，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081）

在土壤重金属污染中，镉（Cd）是影响我国烟草安全性的主要污染元素之一[1-3]。烟草属于易累积Cd的经济作物之一，Cd污染胁迫不仅影响烟草的生理过程，同时也会降低烟叶的品质[3-4]。虽然在近10多年来国内外对烟草重金属的相关研究取得了不少进展[1,5-7]，但主要还是集中在对植烟区土壤和烟叶中的重金属（包括Cd）含量的监测、烟草土壤中重金属的富集研究等，少量研究涉及不同重金属污染对烟叶质量的影响、生理反应及其减控措施等[8-12]，而针对烟草Cd胁迫毒性与环境因子之间的量化关系研究较少。

烟草主要通过根系对Cd进行吸收、累积，因此，不同土壤性质对土壤中Cd的迁移、转化特性有显著影响，如土壤 pH、有机质含量、阳离子交换量及粘粒含量等[1]。除了上述土壤性质外，土壤溶液阳离子组成与含量与烟草对Cd吸收的影响还未见报道。本研究通过水培实验，利用ISO毒性测试方法，研究溶液中 Ca、K离子浓度变化及溶液pH对烟草Cd毒性的影响，以期为烟草Cd减控措施提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

溶液性质变化实验共设钙（Ca）、钾（K）和pH 3个组，实验以8.0 mg/L的Ca（以Ca(NO3)2进行配制）作为背景溶液。8.0 mg/L的Ca2+是土壤孔隙水中Ca2+的最低浓度，也通常作为植物毒性测试的一种背景溶液[13]。溶液 Ca、K 离子浓度的变化范围参照自然土壤孔隙水的离子浓度范围进行设置[13]。本试验中，设置Ca2+离子浓度分别为0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0、400.0 mg/L；设置K+离子（以KNO3进行配制）浓度分别为0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0、256.0 mg/L；溶液pH分别为4.52、5.04、5.57、6.02、6.55、7.09、7.47和8.10。

1.2 溶液配制

用钙与钾的硝酸盐分别配制Ca2+、K+母液，通过添加不同量的母液配制成不同Ca2+、K+浓度的供试溶液。除pH组外，钙与钾溶液分别以2.0 mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液（MES）调节溶液pH为6.0，每组钙与钾离子浓度及不同pH溶液中，通过添加Cd(NO3)2·4H2O，分别配制7个浓度的Cd溶液（0、1.12、2.24、4.48、8.96、17.92、35.84 mg/L），每处理设3次重复。

1.3 毒性测试

根伸长抑制试验参照ISO标准（11269—1）[14]。烟草品种为云烟87。将上述烟草种子在10%（v/v）H2O2中表面消毒10 min后，冲洗干净，放于底部铺有纱布的培养皿上，滤纸用蒸馏水浸湿，然后置于温度为（20±2） ℃无光照的培养箱中直到种子露白。生长箱的光照时间保持在14 h，光强度约为280 μmol/(m2·s)，相对湿度保持在80%，昼夜温度保持在20～25 ℃。培养24 h后，挑选出大小一致、幼根长度约为2 mm的种子进行根伸长抑制水培试验。水培装置采用顶部罩有玻璃纤维网的 PVC培养筒 (直径7.0 cm，高12 cm)，每个处理为10粒种子，暴露于装有不同供试溶液组的培养筒，然后置于培养箱中进行培养。PVC培养筒在培养箱中随机放置，每2 d更换溶液并变换烧杯的位置，培养7 d后测定种子的根长。相对于对照的根的伸长百分比（RE）依据公式计算：

式中，Ret为处理溶液中根的伸长（cm），Rec为对照溶液中根的伸长（cm）。

1.4 测定分析

在进行毒性测试前，经过消化以（石墨）原子吸收光谱法（F-AAS; Varian 220Z）（AAS）对每组溶液中Cd、Ca及K的实际含量进行测定。预备实验结果表明，植物生长2 d对溶液中Cd、Ca及K离子浓度影响可以忽略，因此，溶液每2 d更换1次。用梅特勒pH计（Delta320，Mettler）对溶液的实际pH进行测定，以获得培养溶液最终pH。

1.5 统计分析

剂量-效应曲线拟合：溶液中Cd植物毒性的剂量-效应关系曲线采用逻辑斯蒂克分布模型（Log-logistic distribution）进行拟合[15]。

Log-logistic曲线：

式中，x为溶液中 Cd浓度值（mg/L）；M 为ECx的自然对数值，b为参数。当低剂量毒物刺激效应发生时，采用低剂量毒物刺激效应（hormesis）曲线拟合[15]，通过Table curve 2D-V5.01软件来完成。当溶液中低浓度Cd对烟草产生刺激效应时，采用低剂量刺激效应拟合方程（Hormesis dose-response data fitting）进行毒性效应的拟合，方程如下：

式中，Y是烟草相对根长（%），X是溶液 Cd的浓度（mg/L），a、b、c、d是方程参数。当k为10、50时，参数c定义为EC10及EC50。所有实验数据均采用Excel 2007和SPSS13.0分析软件进行处理，LSD法检测差异显著性（p＜0.05）。

2 结 果

2.1 溶液pH对烟草Cd毒性的影响

溶液 pH对烟草 Cd毒性的影响浓度 EC10、EC50值及其95%置信区间见表1。可以看出，随着pH的升高，Cd对烟草毒性的影响浓度值 EC10、EC50值逐渐增加，且EC50值变化趋势较EC10更为明显，这一结果表明，随着溶液pH的逐渐升高，Cd对烟草胁迫毒性逐渐降低。就EC10变化而言，最低pH（4.52）处理Cd的10%毒害浓度值仅为最高pH（8.10）处理毒害浓度的28.4%，其中在较低pH（＜5.57）条件下，EC10之间差异并不显著，而随着pH逐渐升高，Cd对烟草毒害EC10显著增加；相对EC10而言，溶液pH变化对Cd的50%毒害浓度值影响更为显著，最低pH（4.52）处理Cd的50%毒害浓度值仅为最高 pH（8.10）处理毒害浓度的14.9%，除了pH 6.02和pH 6.55二个处理间EC50没有显著性差异外，EC50值随着溶液 pH的升高EC50 值显著增加（p＜0.05）。

表1 不同pH条件下Cd对烟草毒性的影响Table1 Effect of solution pH on Cd toxicity to tobacco

相关分析结果表明，溶液的pH与烟草Cd毒性影响浓度间呈显著正相关关系，方程为 EC10 =3.2072pH - 12.032，R2= 0.9325**；EC50 = 12.16pH -53.7，R2= 0.7563*）。

2.2 溶液Ca离子浓度对烟草Cd毒性的影响

图1 不同Ca离子浓度条件下Cd对烟草毒性的剂量-效应关系（实线为模型预测值）Fig.1 The dose-response curves of Cd to tobacco with different Ca2+ in solution

通过利用逻辑斯蒂克分布模型并结合低剂量刺激效应拟合方程对8个不同Ca2+浓度下Cd毒性进行了测定。培养溶液中不同Ca2+浓度变化对烟草Cd毒害的剂量-效应关系见图1。从图1A可以看出，在相对低Ca2+浓度（＜64.0 mg/L）处理下，Cd的毒害影响浓度（纵坐标）相同时，随着溶液Ca2+浓度的增加，溶液中Cd的浓度也逐渐增加，换言之，随着溶液 Ca2+浓度的增加，Cd对烟草毒害浓度逐渐降低，烟草Cd的50%毒害浓度EC50与溶液Ca2+浓度之间呈正相关关系（图2），相关关系方程为：EC50 = 0.1775[Ca2+]+ 18.03，R2= 0.8521；而随着溶液 Ca2+浓度的逐渐增加，在相对高 Ca2+浓度（＞128.0 mg/L）处理下（图 1B），随着溶液 Ca2+浓度的增加，Cd对烟草毒害浓度EC50逐渐降低，此表明，溶液中Ca2+浓度的持续增加并不能降低溶液中Cd对烟草的致害浓度值。

图2 溶液中Ca2+离子浓度与Cd对烟草毒性EC50间的关系Fig.2 Relationship between the Cd toxicity (EC50) to tobacco and Ca2+ concentration in solution

2.3 溶液K离子浓度对烟草Cd毒性的影响

溶液不同K+浓度变化对Cd烟草毒性影响浓度见图3。就Cd对烟草毒性影响浓度EC10而言，在相对低浓度（＜64.0 mg/L）条件下，K+浓度的增加并没有显著降低Cd的致害浓度EC10，而随着K+浓度逐渐增加，EC10值显著增加（p＜0.05），不同浓度 K+处理的 Cd的 EC10变化为 8.54～20.23 mg/L。相对EC10而言，溶液中的K+浓度变化对烟草Cd毒性的EC50影响更为明显，从图3可以明显看出，随着溶液中的K+浓度的增加，EC50值逐渐增加，也即表明Cd的毒害显著降低，不同处理Cd的EC50浓度变化为17.29～39.03 mg/L，其中对照处理EC50值为最高K+处理EC50值的44.3%。K+浓度与Cd毒害的EC50值之间呈显著的正相关关系（EC50 = 0.0767[K+]+ 21.276，R2= 0.8709）。

图3 不同K离子浓度条件下Cd对烟草毒性的影响Fig.3 The toxicity thresholds of Cd to tobacco as affected by different K+ concentration in solution

3 讨 论

3.1 溶液pH对Cd毒性的影响

在影响烟草对Cd吸收的土壤性质中，pH是其中重要的影响因子之一。有大量研究结果表明，土壤pH变化是影响烟草对污染土壤中Cd吸收最重要的影响因子之一[1,16-17]。进入土壤中的 Cd2+，以不同结合形态存在于土壤固-液体系中，随着土壤pH的升高，土壤胶体带负电荷逐渐增加，导致土壤胶体对Cd离子的吸附明显增加，从而降低Cd的迁移转化性。

Zachara等[18]对土壤中 Cd的结合形态研究发现，当pH ＞ 8.0时，土壤中的Cd几乎都以氧化铁、铝和硅酸盐等植物无效态存在，而当土壤pH为中、酸性时，Cd则以较多的有机结合形态及可交换态等有效态存在于土壤中。pH变化导致土壤中Cd结合形态的变化是影响烟草对Cd吸收、转化的最根本原因。本试验结果显示，对于 10%的致害浓度（EC10）而言，在溶液pH ＜ 5.57的酸性条件下，随着pH的升高，Cd的毒性虽然有所降低，但并不显著，而随着pH的逐渐升高达到碱性（pH ＞ 7.09）条件下，Cd的毒性显著降低，而这一结果对于半抑制浓度（EC50）的影响更为显著，这可能与Cd在溶液中随着pH升高，其吸附形态的变化有关。

3.2 溶液中Ca、K离子的影响

在烟草对Cd吸收的影响因子中，除了土壤pH外，土壤溶液中阳离子的种类和含量也是其中重要影响因子之一。土壤中的金属阳离子，如Ca、K、Co、Cu、Ni及Pb等，由于和Cd具有类似的物理、化学性质，在一定程度上影响土壤胶体对Cd的吸附-解吸作用，从而影响土壤中 Cd的植物有效性[19-20]。土壤中胶体的种类及其交换性能对 Cd离子的吸附作用大小对烟草Cd吸收有十分重要影响。有研究表明，烟草对土壤中Cd的吸收与土壤的阳离子交换量（CEC）呈明显负相关关系[19]，如Adamu等[21]在13种土壤中烟草对Cd吸收实验结果表明，烟叶中Cd的含量与土壤阳离子交换量呈显著负相关关系；另有资料报道，土壤中的 Zn通过对土壤胶体吸附位的竞争从而影响烟草对Cd的吸收、转化。在烟草根系对Cd吸收转运的过程中，Zn的存在会影响植物根细胞质膜对Cd向韧皮部的转运，而当Zn进入植株体内后，Zn由于和植物蛋白产生竞争络合作用从而影响植物体内Cd的再分配过程，也即产生拮抗效应[22-23]。除了 Zn外，土壤中其他金属元素，如Fe、Ca、K等阳离子的存在也会由于Fe-Cd、Ca-Cd的拮抗作用而降低烟草对Cd的吸收、转运[1]。

烟草根系主要通过H+-ATP酶的作用对溶液中的K+进行主动运输或通过低亲和力的K+内流通道和非选择性的阳离子通道进行被动运输。提高溶液中K+浓度对降低烟草Cd毒性的机制可能与以下原因有关，一是提高K+浓度可以促进烟草的生长，增强烟草对Cd胁迫的耐性，二是由于K+在溶液中通过与 Cd2+竞争阳离子吸附点位及 Cd2+进入植物细胞阳离子运输通道等。本研究结果表明，虽然在低浓度（＜64.0 mg/L）条件下，添加K+在一定程度上增加了烟草Cd胁迫的抗性，但就10%毒性影响浓度（EC10）而言，与对照相比并不显著（p＞0.05），随着溶液中K+浓度的增加，显著降低了溶液中Cd对烟草的毒性，因此，在烟草Cd胁迫条件下，增加介质中K的浓度，可以显著降低Cd对烟草的毒性。

4 结 论

（1）水培试验结果表明，随着溶液pH的升高，Cd对烟草的毒性浓度值 EC10、EC50逐渐增加，也即表明Cd的毒性逐渐降低，溶液的pH与烟草Cd毒性影响浓度值间呈显著正相关关系。

（2）在溶液Ca2+浓度 ＜ 64.0 mg/L处理下，随着溶液 Ca2+浓度的增加，Cd对烟草毒害浓度逐渐降低，烟草Cd的50%毒害浓度EC50与溶液Ca2+浓度之间呈正相关关系；而随着溶液Ca2+浓度的逐渐增加，当Ca2+浓度 ＞ 128.0 mg/L时，溶液中Ca2+浓度的增加并不能降低Cd对烟草的毒性；与Ca2+相比，在相对低浓度（＜ 64.0 mg/L）条件下，K+浓度的增加并没有显著降低Cd的毒性，而随着K+浓度逐渐增加，EC10及EC50值显著增加，溶液中高K+浓度（＞64.0 mg/L）可以显著降低烟草 Cd的毒性。

（3）在烟草Cd污染胁迫条件下，提高介质pH和增加介质中Ca2+、K+的浓度可以有效降低Cd的毒性。

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