绒毛状烟草BAC文库的构建

高晓明，陈艳玲，刘贯山，李凤霞，王卫峰，任媛媛，孙玉合*

（1.中国农业科学院烟草研究所，农业部烟草生物学与加工重点实验室，青岛 266101；2.华大基因研究院，深圳 518083）

近年来，越来越多物种的全基因组已被测序。此为重要基因的克隆、系统进化和基因组学研究提供了坚实的平台。构建细菌人工染色体文库（BAC）是全基因组测序的一个重要环节[1-2]。BAC文库具有插入片段大、嵌合率低、遗传稳定性好、易于操作等优点而备受青睐。目前已经在棉花[3-4]、水稻[5-6]、玉米[7]、大豆[8-9]、高粱[10]、黍[11]和番茄[12]等作物中建立了BAC文库，为测序、基因图位克隆、分子标记、物理作图、基因结构和调控等研究提供了一个重要的技术平台。建立绒毛状烟草（Nicotiana tomentosiformis）的BAC基因组文库，对烟草基因功能、次级代谢途径的研究等均有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草材料为中国农业科学院烟草研究所基地种植的绒毛状烟草。BAC克隆载体采用Epicentre公司的 CopyControlTMBAC Cloning Kit(Hind III)。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞核 DNA 的制备 -80 ℃冷冻保存的嫩叶50 g，液氮研磨约30 min至粉末状，加入500 mL预冷的NIBM（10% TKE，1 mM spermidine，1 mM spermine，0.2%β-巯基乙醇），间歇性轻轻搅拌约15 min。先后用4层纱布和1层miracloth过滤；滤液中加入 1/40体积的 NIBT（10% TKE，1 mM spermidine，1mM spermine，20% Triton X-100），间歇性轻轻搅拌10 min，4 ℃ 2000 g 离心15 min；弃上清，用 50 mL预冷的 NIBM 重悬沉淀，两层miracloth过滤，4 ℃ 2000 g 离心15 min。重复该操作5次。弃上清，用1 mL NIB（10% TKE，1 mM spermidine，1mM spermine）重悬沉淀，45 ℃水浴2～5 min，与用NIB配制的，并经45 ℃水浴的1.5%低熔点胶等体积混合。混匀后转移至模具中，冰上放置30 min形成plugs。制备好的plugs转移至50 mL离心管中，加入20 mL lysis buffer [0.5 M EDTA（pH 9.2），1% lauryl sarcosine，过滤灭菌，加入蛋白酶K至0.3 mg/mL，混匀，50 ℃水浴24 h。倒掉lysis buffer，重新加入新鲜的lysis buffer和蛋白酶K，50 ℃水浴 24 h。倒掉处理液，加入 1×TE（pH8.0），4 ℃冷库震荡30 min。倒掉处理液，加入1×TE（pH 7.6），4 ℃冷库震荡30 min。倒掉处理液，加入含0.2 mM PMSF的10 mL TE缓冲液（pH 7.6），室温静置30 min，重复该操作2次。加入50 mL TE缓冲液（pH 8.0），4 ℃冷库震荡30 min，重复该操作2次。plugs加入50 mL TE缓冲液（pH 8.0），4 ℃保存或用于酶切。

1.2.2 大片段DNA的获得 按照1个plugs在3 mL buffer1（V1×HindⅢ buffer：V1M spermidine：V1M DTT= 3000：6：1）中4 ℃平衡2次，每次30 min的要求，平衡6个plugs。将每个plugs分割成等大的12份，将每4小份的plug加入装有 buffer 2（1×HindⅢ buffer 170 μL；1 M spermidine 0.34 μL；1M DTT 0.17 μL，10 mg/mL BSA2 μL 和1.6 U的HindⅢ）的1.5 mL离心管中，共18管，冰上平衡1.5 h，37 ℃水浴8 min；加入1/10体积的0.5 M EDTA（pH8.0），4 ℃放置30 min；脉冲场电泳进行胶回收，电泳分为2个Block。Block1：起始脉冲时间90 s，终止脉冲时间90 s，温度12.5 ℃，角度120°，电压6 V/cm，电泳时间14 h；Block2：起始脉冲时间5 s，终止脉冲时间5 s，温度12.5 ℃，角度120°，电压4 V/cm，电泳时间2 h。电泳结束后切下100～150 kb部分和150～200 kb部分。所得胶条经透析后进行二次脉冲场凝胶电泳，电泳条件为起始脉冲时间5 s，终止脉冲时间5 s，温度12.5 ℃，角度120°，电压4 V/cm，电泳时间14 h。切胶回收，脉冲电泳透析，将透析袋中溶液用于连接。

1.2.3 大片段DNA与BAC载体的连接与转化 连接体系如下：DNA12.5 µL（25 ng），载体 0.75 µL（18.75 ng），纯化水8.5 µL，混匀，55 ℃ 10 min，RT 15 min，再加入 10×Ligase Buffer2.5 µL，100 mM ATP0.25 µL，2 U/µL Fast link ligase 0.5 µL，16 ℃连接16 h；连接液中加入0.4 µL 0.5 M EDTA（pH8.0）和 0.4 µL 20 mg/mL 蛋白酶 K，混匀，37 ℃水浴1 h；加入0.4 µL 100 mM PMSF，混匀，RT 1h；将连接液点在0.025 µm Millipore膜中间，置于含冰冷纯化水的平皿中，脱盐2 h。将2 µL连接产物和20 µL感受态细胞EPI 300混匀，电击转化，吸出转化液，迅速加入900 μL SOC液体培养基，吸打混匀；摇床180 rpm，37 ℃复苏60 min。取300 µL复苏液均匀的涂布在LB（用前涂100 µL VX-gal：VIPTG= 1：4混合液）上，37 ℃培养过夜。

1.2.4 BAC单克隆插入DNA片段大小的鉴定 随机挑取单克隆，分别接种于3 mL LB液体培养基，200 rmp，37 ℃，震荡培养过夜，提取质粒DNA，Not I酶切后进行脉冲场电泳检测，电泳条件为：起始脉冲时间0.1 s，终止脉冲时间40 s，温度14 ℃，角度120°，电压6 V/cm，电泳时间14 h。计算平均插入片段和空载率。

1.2.5 单克隆的挑取与保存 取白斑，接种于含有冻存缓冲液的细菌培养板中，37 ℃，培养16 h，用铝箔封好，-80 ℃保存。

2 结 果

2.1 高质量高浓度细胞核DNA的制备

高效连接的 BAC克隆很大程度上取决于核DNA包埋胶块plug中核DNA的浓度和纯度。由于烟草叶片组织中含有较多的酚类等次级代谢产物，大大降低了细胞核DNA质量，因此本试验选用烟草幼嫩组织为材料来制备高分子量DNA，幼嫩组织代谢产物少。制备细胞核 DNA时按照常规方法NIBM溶液中β-巯基乙醇的浓度为0.15%，搅拌10 min，制备出的plug颜色为微微的乳黄色，半透明，说明仍含有来自叶片的酚类物质以及细胞壁残渣，这些残留的物质会降低后续酶切的消化效率。因此试验中将β-巯基乙醇的浓度调整为0.2%，搅拌15 min，制备出的plug为无色透明，这说明得到的核DNA比较纯净，提高了核DNA的质量。

2.2 BAC文库的质量检测

2.2.1 插入片段大小分析 用限制性核酸内切酶HindIII，对包埋的烟草高分子量核DNA进行消化，通过调节酶切时间及酶浓度，就可以获得长度适合建库的高分子量核 DNA。在进行大规模的酶切之前，先通过小范围的酶切试验确定最佳的酶切时间和酶浓度。随机挑取100个单克隆，提其质粒并酶切鉴定插入片段大小。结果表明：插入片段分布在50～200 kb之间，平均插入片段约为110 kb，空载率＜2%（图1）。

图1 插入片段Not I酶切检测Fig.1 PFGE analysis of insert size of the randomly picked clones

2.2.2 BAC克隆稳定性分析 随机挑取15个BAC单菌落，连续培养100代；提取第0代和第100代的BAC质粒DNA，分别进行EcoRІ酶切，进行脉冲场电泳检测。结果表明，经继代培养后，BAC克隆的酶切带形一致（图2）。说明BAC克隆中的插入片段至少可以稳定遗传100代。

图2 继代稳定性EcoRІ酶切检测Fig.2 Stability analysis of BAC clones

3 讨 论

烟草作为重要的经济作物，在农业经济和国际贸易中占有重要地位。目前生产上应用最普遍、经济价值最大的栽培种普通烟草[Nicotiana tabacum(SSTT，2n=4X=48)]，是由林烟草[N.sylvestris (SS，2n=24) ]和绒毛状烟草(TT，2n=24)种间杂交形成的一个不育的杂交种，经染色体加倍后形成的可育异源四倍体，进化成为现在的商业化栽培种。绒毛状烟草是普通烟草的原始亲本之一，基因组大小约为 2300 M。在确定绒毛状烟草的全基因组序列后，可以更加方便地确定其它烟草属内其它种的基因组序列，从而掌握普通烟草及其近缘野生种的完整序列信息。

目前大片段文库构建技术已经十分成熟，但是相对于普通文库的构建来说，依然存在技术上的难点。高质量高浓度的细胞核DNA插入片段的制备是 BAC文库能否构建成功的最基本条件。植物材料的选取直接影响细胞核的质量。本试验所用材料取自田间幼嫩叶片，叶绿体含量低，酚类及其它次级代谢产物含量低，很好地保证了试验所需细胞核的质量。为减少提取过程中细胞核的物理损伤和防止高分子量DNA的物理打断，植物组织研磨不能太细，包埋细胞核的操作及酶切、连接的操作必须动作轻柔，使用广口枪头。

高分子量的大小均一的插入片段是构建 BAC文库最关键的环节之一[13-14]，设计一系列小规模酶切试验以确定最佳酶切时间和酶浓度是十分重要的。Karutoyo等[15]的研究结果表明，如果酶用量过大可能导致非特异性酶切，这种非特异性酶切虽然在整个酶切反应体系中发生的几率很小，但结果却会产生很高比例的假阳性，从而导致整个文库的空载率过高。

在连接反应中，尽量避免在插入片断中混有小片段。片段太小建库的重复次数、克隆保存数等就会增加很多。片段太大会降低连接转化效率。

转化反应也是重要步骤之一。整个转化过程越快越好，操作要熟练，动作越快转化效率越高。同时，转化环境要求低离子强度，故在连接反应之后要对连接产物进行脱盐处理。Allouis等[16]的试验表明，转化条件是影响大片段基因组文库插入片段大小的关键因素。BAC载体理论上可以携带 300 kb的外源基因片段，但现在所有的 BAC文库平均插入片段在150 kb左右，可见优化目前的转化条件以提高插入片段的大小是急需解决的问题。

本试验成功地构建了绒毛烟草 BAC文库，为进一步克隆重要功能基因提供了必备的物质平台。

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