辛伐他汀对COPD大鼠肺组织细胞凋亡的影响及其机制探讨

王 伟，吴 倩，丁启翠，黄建安

(1苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006;2山东大学第二医院)

研究［1］发现，肺组织细胞凋亡参与慢性阻塞性肺疾病(COPD)的发生、发展过程，且与Caspase-3、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等细胞凋亡相关因子有关。他汀类药物为羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，除调脂作用之外还具有调节细胞凋亡的作用［2］。2008年12月～2011年7月，我们观察了辛伐他汀对COPD大鼠肺组织细胞凋亡的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 30只SPF级成年雄性Wistar大鼠，体质量(228.6±7.4)g;脂多糖，辛伐他汀片(10 mg/片)，哈德门牌香烟;Trizol、PCR试剂盒及反转录试剂盒，TUNEL 试剂盒;Caspase-3、iNOS、eNOS 引物由上海生物工程公司合成。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及造模 将30只大鼠随机分为正常组、对照组、治疗组，每组10只。正常组行标准饲养，不进行干预;对照组参照文献等［3，4］制作 COPD模型;治疗组造模方法与对照组相同，于香烟暴露2周后，给予辛伐他汀2.5 mg/kg灌胃，连续治疗6周。

1.2.2 动物处置及标本采集 造模成功后，腹腔注射10%水合氯醛300 mg/kg麻醉大鼠;固定后打开胸腹腔，用10 mL的注射器抽净下腔静脉血。用组织剪剪破左心房，以静脉输液器经右心室，灌注适量生理盐水;将肺内血管床中的残留血液冲洗干净，取出右肺，浸入4%多聚甲醛中固定72 h;常规石蜡包埋，制备5μm厚石蜡切片，其余肺组织于液氮中保存。

1.2.3 COPD大鼠肺组织原位细胞凋亡的检测采用TUNEL法。冰冻切片干燥及过氧化物酶阻断后，室温孵育 10 min，PBS冲洗 5 min，3次。0.1 mol/L的TBS以1∶100稀释蛋白酶K 37℃消化10 min，按每张切片取末端脱氧核酸转移酶(TdT)和DIG-d-UTP各1μL，加10μL抗体稀释液，每片加标记液20μL，湿盒37 ℃孵育2 h，PBS冲洗5 min，3次。滴加封闭液，每片50μL，室温孵育50 min，PBS冲洗5 min，3次。用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，每片50μL，37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min，3次。DAB显色，苏木素复染，常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，甘油封片。光镜下计数500个细胞中TUNEL染色阳性细胞数(细胞核呈现棕色或者棕黄色)。凋亡指数(AI)=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

1.2.4 COPD 大鼠肺组织中 iNOS、eNOS、Caspase-3 mRNA的检测 采用RT-PCR技术。根据用Trizol试剂提取肺组织总RNA，紫外分光光度仪鉴定其浓度及纯度，琼脂糖凝胶电泳鉴定完整性。RNA反转录成 cDNA:反应管中依次加入5×Prime Script buffer 2 μL，Prime Script RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT primer(50 μM)0.5 μL，Random 6 mers(100μM)0.5μL，每10 μL体系中加入500 ng的总RNA;最后加Rnase Free dH2O至10μL，37℃ 15 min，85 ℃ 5 s。cDNA 扩增:94 ℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72℃ 1.5 min，40个循环72℃ 10 min;扩增产物于2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察，以扩增产物的吸光度比值表示目的基因的相对表达量。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。组间比较应用单因素方差分析，两变量之间的关系用Pearson相关分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠支气管及肺组织细胞AI比较 各组大鼠气道上皮细胞及肺泡上皮细胞AI比较，见表1。

表1 各组大鼠气道上皮细胞及肺泡上皮细胞AI比较(±s)

表1 各组大鼠气道上皮细胞及肺泡上皮细胞AI比较(±s)

注:与正常组比较，*P ＜0.05;与对照组比较，#P ＜0.05

组别 n AI(%)气道上皮细胞 肺泡上皮细胞正常组对照组治疗组10 3.55 ±0.87 6.21 ±1.28 10 17.86 ±2.71* 31.41 ±2.67* 10 10.20 ±1.52*# 20.98 ±3.00*#

2.2 各组大鼠肺组织中 iNOS、eNOS、Caspase-3 mRNA检测结果 各组大鼠肺组织中的Caspase-3、iNOS、eNOSmRNA相对表达量比较，见表2。

表2 各组大鼠肺组织中Caspase-3、iNOS、eNOSm RNA相对表达量比较(±s)

表2 各组大鼠肺组织中Caspase-3、iNOS、eNOSm RNA相对表达量比较(±s)

注:与正常组比较，*P ＜0.05，与对照组比较，#P ＜0.05

组别 n Caspase-3 iNOS eNOS正常组10 0.47 ±0.067 0.45 ±0.049 0.86 ±0.100对照组 10 0.83 ±0.050* 0.89 ±0.057* 0.46 ±0.053*治疗组 10 0.70 ±0.068*#0.72 ±0.054*#0.63 ±0.072*#

2.4 各组大鼠肺组织中 iNOS、eNOS、Caspase-3 mRNA表达的关系 各组大鼠肺组织中Caspase-3 mRNA表达与iNOSmRNA表达呈正相关(r分别为0.94、0.89、0.91，P ＜0.05)，与 eNOSmRNA 表达呈负相关(r分别为 －0.88、－0.65、－0.92，P ＜0.05)。

3 讨论

研究发现，辛伐他汀除具有调脂作用外，还具有调节细胞凋亡的作用［2］。本研究结果显示，应用辛伐他汀治疗后，大鼠肺泡上皮细胞和气道上皮细胞凋亡减少。目前有研究［5～7］发现，辛伐他汀可以通过增加eNOSmRNA稳定性和提高一氧化氮(NO)的生物活性来抑制Caspase-3活性，减少细胞调亡。

Caspase家族是细胞凋亡的核心，不同的刺激诱发凋亡过程激活的Caspase不尽相同，但Caspase-3是不同凋亡途径的必经之路，是细胞凋亡的执行者。研究［8～10］发现，肺组织和气道凋亡的细胞增多与Capase-3的激活有关。本研究发现，对照组大鼠肺组织Caspase-3 mRNA表达较正常组增多，而辛伐他汀治疗后大鼠肺组织Caspase-3 mRNA表达较对照组明显减少，表明辛伐他汀能够通过减少Caspase-3基因的转录，从而减轻COPD大鼠肺组织细胞的凋亡。

一氧化氮合酶(NOS)是NO合成中最主要的限速酶，可分为神经元型一氧化氮合酶(nNOS)、eNOS、iNOS［11］。在呼吸系统中，NOS 广泛存在于多种组织中，且三种酶的作用各不相同。eNOS在正常生理状态下含量较高，而iNOS在病理状态下高表达。由nNOS和eNOS催化合成的NO，在呼吸系统中发挥生理性作用。生理情况下，iNOS在正常的气道上皮及巨噬细胞可有表达，产生的NO可以抵抗外界有害物质的侵袭;在各种炎症性肺疾病中，如哮喘、COPD、特发性肺纤维化和肺囊性纤维化，气道和肺周围实质中iNOS的表达上调［12］。各种介质如TNF-α、干扰素γ、白细胞介素-1β和LPS等，均可以诱导iNOS的表达。Rus等［13］通过研究大鼠缺氧与复氧过程中肺组织中eNOS来源的NO的作用，发现当抑制eNOS的作用时，大鼠NO的产生水平明显降低，而脂质过氧化物水平、细胞凋亡均明显升高。Rus等［14］还发现，抑制iNOS产生的NO可以降低脂质过氧化物、细胞凋亡以及硝基化蛋白质的水平［17］。本研究结果显示，对照组大鼠肺组织eNOS mRNA表达较正常组减少，而辛伐他汀治疗后大鼠肺组织eNOSmRNA表达较对照组明显增多;对照组大鼠肺组织iNOSmRNA表达较正常组增多，而辛伐他汀治疗后大鼠肺组织iNOSmRNA表达较对照组明显减少;可见辛伐他汀能通过促进COPD模型大鼠肺组织eNOSmRNA的转录，减少iNOSmRNA的转录，进而减少肺组织凋亡，减轻肺组织的破坏，为辛伐他汀在COPD中的应用提供了理论依据。

Caspase-3是细胞凋亡的最后执行者，本实验发现Caspase-3 mRNA与iNOSmRNA的表达呈正相关，与eNOSmRNA的表达呈负相关，考虑与iNOS的表达能够诱导细胞凋亡，eNOS的表达减轻细胞凋亡有关。

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