玉竹单体化合物对PC12细胞氧化损伤的保护作用

(山东省医学科学院药物研究所、山东省罕少见病重点实验室，济南250062)

中药玉竹为百合科黄精属植物玉竹的干燥根茎，味甘，微寒，临床常用于治疗肺胃阴伤、燥热咳嗽、小便频数等症。此外，玉竹还具有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤和提高机体免疫力等作用［1～3］。目前，对玉竹的研究多限制在其提取部位或多组分的药理活性研究，而对其单一有效成分和药理作用机制的研究报道较少。2011年11～12月，本实验采用PC12神经细胞经氧自由基损伤和缺氧损伤为模型，观察从玉竹中提取的两个单体化合物4'，5，7-三羟基-6-甲基-8-甲氧基-高异黄酮(以下简称高异黄酮)和N-反式阿魏酸酪酰胺(以下简称阿魏酸酪酰胺)对神经细胞氧化损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12神经细胞株购自中科院上海细胞库。高异黄酮和阿魏酸酪酰胺由本所天然药化室提供，经HPLC和NMR检验［4］纯度均＞99%。准确称取化合物各1 mg，分别加入50μL DMSO溶解，用含10%小牛血清的RPMI1640细胞培养液稀释至作用终浓度分别为 1 ×10－4、2 ×10－5、4 ×10－6、8 ×10－7和1.6 ×10－7mol/L，无菌过滤备用。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取指数生长期PC12细胞，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×105/mL，按每孔100μL接种到96孔培养板内，于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，分别加入不同浓度的化合物，阳性对照组为三七总皂苷注射液(50μg/mL)，阴性对照组为相同体积的细胞培养液，每组设3个平行孔，继续常规培养24 h。

1.2.2 PC12细胞氧自由基损伤和缺氧损伤模型的制备［5］分别取化合物作用后的细胞，自由基损伤模型加入H2O2，调整终浓度为1×10－4mol/L，继续常规培养4 h;缺氧损伤模型加入Na2S2O4，调整终浓度为1×10－3mol/L，继续常规培养12 h。

1.2.3 MTT比色法观察化合物对PC12细胞经氧自由基损伤和缺氧损伤的保护作用 取上述细胞，每孔加10μL 0.5% 的 MTT，置5%CO2孵箱内孵育4 h。离心，倾去孔内液体，每孔加入200μL DMSO振摇10 min，使结晶充分溶解，于Victor1420多标记检测仪上575 nm处测定各孔吸光度OD值，根据其OD值计算细胞存活率。存活率(%)=(供试品组OD/阴性对照组OD)×100%。

1.2.4 统计学方法 使用SPSS11.0统计软件进行数据分析，率的比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

高异黄酮在浓度为1×10－4和2×10－5mol/L时，阿魏酸酪酰胺在浓度为 1 ×10－4、2 ×10－5、4 ×10－6和8×10－7mol/L时对PC12细胞氧自由基损伤具有明显保护作用，细胞存活率明显升高，并具有良好的剂量—效应关系，与模型组比较有统计学差异(P＜0.01或 ＜0.05)。此外，高异黄酮浓度为1×10－4mol/L时，阿魏酸酪酰胺浓度为 1 ×10－4、2 ×10－5mol/L时对PC12细胞缺氧损伤具有较好的保护作用，细胞存活率与模型组比较有统计学差异(P均＜0.05)。结果见表1。

表1 玉竹单体化合物对H2 O2、Na2 S2O4损伤PC12细胞的保护作用(%，±s)

表1 玉竹单体化合物对H2 O2、Na2 S2O4损伤PC12细胞的保护作用(%，±s)

注:与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 H2 O2损伤细胞存活率Na2 S2O4损伤细胞存活率阴性对照组100.0 ±0.0 100.0 ±0.0模型组 59.0 ±2.2 71.1 ±3.5阳性对照组 69.6±2.6＊＊ 91.8±3.2*高异黄酮组1 ×10 －4 68.1 ±1.8＊＊ 84.4 ±3.9*2 ×10 －5 64.9 ±2.1* 78.9 ±2.5 4 ×10 －6 61.7 ±1.7 78.9 ±3.4 8 ×10 －7 60.1 ±2.4 73.3 ±2.5 1.6 ×10 －7 59.8 ±4.2 72.6 ±3.4阿魏酸酪酰胺组1 ×10 －4 72.4 ±2.6＊＊ 91.4 ±4.8*2 ×10 －5 69.8 ±4.4＊＊ 85.6 ±1.1*4 ×10 －6 67.4 ±3.0* 82.2 ±3.7 8 ×10 －7 65.2 ±1.4* 73.7 ±4.3 1.6 ×10－764.5 ±3.0 73.4 ±2.7

3 讨论

中药玉竹的化学提取成分主要包括甾体皂苷、黄酮、生物碱、多糖、甾醇、鞣质、黏液质和强心苷等［1］。我们在前期研究中，从玉竹的正丁醇提取物中分离得到18个化合物［4］，本文进一步分析玉竹中分离得到的含量较大、活性较好的两种化合物高异黄酮和阿魏酸酪酰胺对PC12神经细胞氧化损伤的保护作用。高异黄酮属于黄酮化合物中特殊的一类，母体结构较异黄酮多出一个碳原子。目前，黄酮类化合物的抗氧化性质已引起学者们的广泛关注。章丹丹等［5］采用细胞学实验和体外化学实验相结合的方法综合评价了桑枝总黄酮的抗氧化活性，结果表明桑枝总黄酮具有较强的自由基清除能力。张昕原等［6］研究了广枣总黄酮对大鼠心肌细胞过氧化损伤的保护作用，发现广枣总黄酮通过清除自由基，抑制脂质过氧化反应，维持心肌细胞膜结构和功能的完整性，从而对心肌起保护作用。黄酮类化合物抗氧化机理有两大类:一类是络合具有促氧化作用的金属离子，另一类是清除自由基［7］。许多以黄酮类成分为主的制剂已作为成药上市，如以葛根素为主的愈风宁心片可用于缓解高血压症状，治疗冠心病心绞痛等［8］;以银杏叶总黄酮为主的天保宁是治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、脑血栓等疾病的新药，对冠心病合并高脂血症患者具有降低血清总胆固醇、升高高密度脂蛋白的作用［9］。N-反式阿魏酸酪酰胺为阿魏酸酰胺类衍生物，阿魏酸具有抗血小板聚集、抗氧化、抗自由基、抗菌消炎、抗肿瘤、抗突变、增强免疫功能等多方面的生物活性［10］。作为公认的天然抗氧化剂，阿魏酸对H2O2、超氧自由基、羟自由基、过氧化亚硝基都有强烈的清除作用。此外，阿魏酸还能调节人体生理机能，抑制产生自由基的酶，促进清除自由基的酶的产生。据报道，阿魏酸能大大增加谷胱甘肽转硫酶和醌还原酶的活性，抑制酪氨酸酶活性，并能与膜磷脂酰乙胺结合，保护膜脂不受自由基的侵袭［11］。本实验显示，N-反式阿魏酸酪酰胺体外对氧自由基损伤和缺氧损伤的神经细胞均具有良好的保护作用，这可能是中药玉竹抗氧化作用的物质基础之一，进一步研究其保护作用机理，对于新药开发和临床心脑血管疾病的治疗均具有积极的意义。

［1］晏春耕，曹瑞芳.玉竹的研究进展与开发利用［J］.中国现代中药，2007，9(4):33-36.

［2］梁海霞，李焕德.玉竹的药理活性研究进展［J］.中南药学，2008，6(3):342-344.

［3］徐大量，林辉，李盛青，等.玉竹水提液体内外抗氧化的实验研究［J］.中药材，2008，31(5):721-731.

［4］李海明.玉竹化学成分研究［D］.山东省医学科学院硕士学位论文.2010.

［5］章丹丹，高月红，Jessica Tao Li，等.桑枝总黄酮的抗氧化活性研究［J］.中成药，2011，33(6):943-946.

［6］张昕原，包保全，王志民，等.广枣总黄酮对阿霉素致大鼠心肌细胞过氧化损伤的保护作用［J］.中药材，2001，24(3):185-187.

［7］刘莉华，宛晓春，李大祥.黄酮类化合物抗氧化活性构效关系的研究展望［J］.安徽农业大学学报，2002，29(3):265-270.

［8］孙学刚.愈风宁心片治疗冠心病心绞痛的临床观察［J］.陕西中医学院学报，2003，26(4):16.

［9］白宏波，周斌，霍国安，等.天保宁治疗冠心病的临床观察［J］.河南职工医学院学报，2000，12(2):44-45.

［10］马逢时，李家明，李传润，等.阿魏酸衍生物及其生物活性［J］.药学进展，2008，32(8):345-350.

［11］周慧君，杨积武.氧自由基与冠心病及其中医药研究［J］.辽宁中医学院学报，1999，1(2):67-69.