鼠伤寒沙门氏菌SL1344株△crp△cya缺失株的构建及其生物学特性初步研究

李 正，程相朝，张春杰，李银聚，李 静，张明亮，田芳华，杨宁宁

(河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471003)

鼠伤寒沙门氏菌(Salminella typhimurium)是一种肠道致病菌，对养禽业危害严重，常因伴发或继发感染其它疾病或治疗不及时而发生大批死亡，给养禽业造成重大损失，同时又是重要的人类食物源性病原体。由于抗菌药物的广泛应用，该类菌株耐药性日趋严重以及基于食品安全的考虑，免疫预防S.typhimurium疾病更为重要，但目前仍没有能够很好控制S.typhimurium病的活疫苗，而常规灭活疫苗不能产生很好的免疫力以抵御野毒的感染[1-2]。

通过基因工程方法减毒的沙门氏菌对人和动物的致病力显著降低，但仍然保持良好的感染性和免疫原性[3]。目前已有多个毒力相关基因被鉴定，并在此基础上构建了一系列毒力基因突变的减毒沙门氏菌株。编码环化腺苷酸合成酶的cya和编码环化腺苷酸受体蛋白的crp作为沙门氏菌的毒力调节基因研究已很深入，而国内尚未见构建S.typhimurium crp/cya基因双缺失株的报道，均为国外引进此类菌株作为载体或疫苗进行研究。本实验室已经构建 S.typhimuriumSL1344△cya基因缺失突变株，但其免疫原性还未得到证实，为探索更加安全和免疫原性良好的减毒株，本研究在SL1344△cya的基础上，以crp基因作为减毒基因，采用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术构建S.typhimurium SL1344△crp△cya双基因缺失突变株，研究其生物学特性，进而为开发更加安全有效的S.typhimurium弱毒疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌株、质粒和培养条件 S.typhimurium SL1344由南京农业大学馈赠；SL1344△cya、自杀性质粒pRE112△crp(oriT oriV△asdCmrSacB)及其宿主菌大肠杆菌 χ7213(Thi-1 thr-1 leuB6 fhuA21 lacY1 glnV44△asdA4 recA1 RP42-Tc∷ Mu[λpir]Kmr)由本实验室构建。各培养基根据需要加入终浓度为25μg/mL的氯霉素(Chloramphenicol，Cm)、100μg/mL的氨苄青霉素(Amplicillin，Amp)、50μg/mL的二氨基庚二酸(D L-α，ε-Diaminopimelic acid，DAP)。

1.2 主要试剂、培养基和实验动物 各种生化鉴定试剂购自杭州天和微生物试剂有限公司；沙门氏菌属诊断血清(11种)及各种单因子血清购自宁波天润生物药业有限公司；DAP、蔗糖购自美国Sigma-Aldrich公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker、pMD18-T、T4 DNA Ligase和限制性内切酶均购自TaKaRa公司；麦康凯琼脂和SS琼脂培养基购自广东环凯微生物科技有限公司；LB培养基购自英国OXOID公司。常规方法检测沙门氏菌阴性的1日龄健康罗曼雏公鸡，购自洛阳公华种鸡场。

1.3 引物设计 参照文献[4]设计引物(表1)。根据GenBank中已登录的S.typhimuriumLT2(AE008859)crp基因序列设计crp基因相关引物；根据S.typhimurium invA基因序列合成特异性引物Pi1/Pi2用于沙门氏菌的扩增鉴定。各引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 PCR扩增所用的引物序列Table 1 The primer sequences for PCR amplification

1.4 S.typhimuriumSL1344株△crp△cya双缺失株的构建 根据文献[4]的方法并加以改良，通过重组自杀性质粒介导细菌基因接合转移的作用，二步法筛选基因缺失突变株。以转化了重组自杀性质粒pRE△crp的大肠杆菌 χ7213为供体菌，SL1344△cya为受体菌进行接合转移。供体菌和受体菌分别经37℃培养过夜，供体菌和受体菌菌液各取100 μL混合后加入含有DAP的LB液体培养液1 mL，37℃培养24 h，取500 μL菌液涂布于含Cm的LB固体平板，37℃培养过夜，挑取Cm抗性菌落进一步接种于含蔗糖的LB固体平板验证其蔗糖敏感性，再用引物T1/T2扩增鉴定Cm抗性蔗糖敏感(Cmr/SUCs)菌。将Cmr/SUCs阳性接合子转接于含5%蔗糖无抗性无NaCl的LB(NB)低营养液体培养基中，37℃培养过夜，连续10倍稀释，选取合适的稀释度涂布于含5%蔗糖的NB琼脂固体平板，筛选出Cm敏感蔗糖抗性(Cms/SUCr)的菌落。提取基因组，采用引物T1/T2扩增鉴定，阳性缺失株进一步用引物T2/T3扩增鉴定。

1.5 缺失株SL1344△crp△cya的生物学特性研究

1.5.1 缺失株SL1344△crp△cya表型鉴定 将SL1344△crp△cya、亲本株SL1344△cya与野生型菌株SL1344分别划线接种于含和不含1%麦芽糖的麦康凯平板上，将细菌转接葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇、阿拉伯糖等生化鉴定管，并进行O和H抗原等相关血清型鉴定，研究其生化特性。

1.5.2 缺失株SL1344△crp△cya的遗传稳定性将缺失株SL1344△crp△cya接种于LB固体培养基中连续盲传 60代，挑取第 10、20、30、40、50、60代单菌落，用引物T3/T2 PCR扩增鉴定，以研究crp缺失基因在双缺失株中的遗传稳定性。

1.5.3 缺失株SL1344△crp△cya的生长特性 缺失株SL1344△crp△cya、亲本株SL1344△cya与野生株SL134437℃培养过夜，无菌生理盐水连续10倍稀释，取100 μL适当稀释度菌液均匀涂布于平板上，每个稀释度做3个重复，37℃过夜培养，进行菌落计数，取平均值推算原液CFU。调整终浓度约为106cfu/mL后，经37℃、200 r/min培养，每1 h取样平板计数，绘制生长曲线。

1.5.4 缺失株SL1344△crp△cya的毒力测定 缺失株SL1344△crp△cya与野生株SL1344在LB液体培养基中37℃培养过夜，按1.5.3所述方法平板计数推算接种剂量，无菌生理盐水连续5倍稀释或5倍浓缩，选取合适的浓度，每个浓度500 μL/只口服感染10只1日龄雏鸡，观察直至无鸡只死亡，同时设生理盐水、空白对照。死亡雏鸡肝脏无菌接种SS和含有1%麦芽糖的麦康凯琼脂平板，用引物Pi1/Pi2扩增鉴定，统计死亡情况，根据Bliss法计算菌株对雏鸡的半数致死量(LD50)。

2 结果

2.1 缺失株 SL1344△crp△cya的构建及筛选χ7213(pRE△crp)与SL1344△cya接合转移后发生第一次同源臂间的单交换，用crp一条上臂内部引物T1和一条下臂内部引物T2扩增结合子，得到约为918 bp和599 bp两条DNA片段(图1A)。阳性接合子呈Cm抗性，但同时对蔗糖敏感(Cmr/SUCs)。由于自杀性质粒pRE△crp被整合到SL1344△cya染色体中，crp则具有两个拷贝，出现缺失型和野生型两条片段。pRE△crp含有负向选择基因(sacB蔗糖敏感基因)，阳性接合子在含5%蔗糖无抗性无NaCl的LB(NB)液体培养基连续传代培养中发生第二次同源重组，用引物T1/T2扩增产生两种结果，一种是突变型扩增产物为599 bp大小的片段，一种是恢复野生型大小为918 bp(图1B)。为了进一步证明该同源重组是发生在SL1344△cya的染色体而不是重组自杀性质粒中，用crp一条下臂内部引物T2和一条上臂以外染色体上的引物T3扩增鉴定阳性缺失株，同样有两种结果，缺失株扩增出1412 bp片段，野生型扩增出1731 bp片段，而pRE△crp无任何条带(图1C)。PCR鉴定结果表明筛选得到的Cm敏感和蔗糖抗性(Cms/SUCr)缺失株即为SL1344△crp△cya。

图1 缺失株SL1344△crp△cya株PCR鉴定Fig.1 Identification of SL1344△crp△cyamutant by PCR

2.2 缺失株SL1344△crp△cya的生物学特性

2.2.1 缺失株SL1344△crp△cya的表型鉴定 野生株SL1344能够利用麦芽糖，在含有麦芽糖的麦康凯琼脂平板上呈红色菌落。构建的双缺失株SL1344△crp△cya与亲本株SL1344△cya保持一致，不能利用麦芽糖，因此在含麦芽糖的麦康凯琼脂平板上呈无色菌落。进一步的生化鉴定结果表明，双缺失株与野生株相比，生化特性变化明显，SL1344△crp△cya失去利用麦芽糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇等碳源的能力，也不能分解H2S，但保留利用葡萄糖的能力，这些特性均与亲本株SL1344△cya一致。SL1344△crp△cya 的血清型为 1，4，5，12∶i∶1，2，同亲本株与野生株相同，没有发生变化(表2)。

2.2.2 缺失株SL1344△crp△cya的遗传稳定性 将缺失株SL1344△crp△cya在LB固体培养基上连续培养60代，应用引物T3/T2 PCR扩增鉴定第10、20、30、40、50、60代的单菌落，均能得到缺失型的1412 bp的△crp片段，亲本株SL1344△cya扩增得到野生型的1731 bp的crp片段(图2)，这表明缺失株SL1344△crp△cya能够稳定遗传缺失了319 bp的crp基因片段。

表2 缺失株SL1344△crp△cya、亲本株SL1344△cya与野生株SL1344在培养基上的生长情况Table 2 The growth of SL1344△crp△cyamutant,the parent SL1344△cyastrain and the SL1344 on medium

图2 PCR鉴定缺失株△crpSL1344的稳定性Fig.2 Stability identification of of SL1344△crp△cya mutant by PCR

2.2.3 缺失株SL1344△crp△cya的生长特性 将双缺失株SL1344△crp△cya、亲本株 SL1344△cya及野生株SL1344分别在麦康凯培养基上经37℃培养24 h后，平均菌落直径分别为0.4 mm、0.8 mm和1.7 mm。调整菌液浓度后，从约106cfu继续培养，每1 h取样，平板计数。结果显示双缺失株SL1344△crp△cya与亲本株SL1344△cya生长速度都明显慢于野生株SL1344，但SL1344△crp△cya的生长更为缓慢（图3）。

2.2.4 缺失株SL1344△crp△cya的毒力测定 口服感染不同浓度野生株的雏鸡，呈现不同程度的死亡；口服感染SL1344△crp△cya的雏鸡，各剂量组均未发生死亡，仅在1010和1011两个较高浓度组出现精神欠佳、食欲减退及轻微下痢症状。无菌生理盐水和空白对照组雏鸡均表现正常。死亡雏鸡剖检后均呈现典型的沙门氏菌病变。采集各组死亡雏鸡的肝脏无菌接种到SS琼脂上，取其菌落用引物Pi1/Pi2均能扩增出约580 bp的特异性DNA条带；血清型鉴定结果表明，分离细菌的抗原式均为1，4，5，12∶i∶1，2，由此可以证明死亡雏鸡是感染S.typhimurium所致。应用Bliss法计算，野生株SL1344的LD50为2.28×105，由此可以推断缺失株SL1344△crp△cya的毒力较其至少降低了106倍(表3)。

图3 SL1344△crp△cya、亲本株SL1344△cya与野生株SL1344的生长曲线Fig.3 The growth curves of SL1344△crp△cya,SL1344△cyaand SL1344

表3 缺失株SL1344△crp△cya和野生株SL1344的毒力测定Table 3 Mortality of chicks post oral infection with SL1344△crp△cyaor SL1344 strain

3 讨论

常规灭活疫苗产生的保护水平低且持续时间短[5]，近年来通过基因工程方法构建减毒沙门氏菌作为口服疫苗及其作为疫苗活载体表达外源抗原已成为研究热点[6]。cya和crp基因编码的蛋白具有多种调节功能，包括碳水化合物及氨基酸的利用，细菌代谢过程中某些基因的转录，营养物质的运送和分解，一些氨基酸渗透酶的合成，鞭毛、菌毛的合成，外膜蛋白的合成以及多种基因表达等；crp与cya基因的突变势必影响菌体的正常代谢速率、生理合成功能及多种基因的表达等，从而降低毒力，但仍能够在普通培养基上生长[7]。Curtiss用Tn10转座得到含有或不含毒力质粒pStSR100的具有镰孢菌抗性的S.typhimuriumSR-11株的crp与cya突变株，这些突变株对小鼠无毒性但具有良好的免疫原性[8]。徐引弟等在毒力较弱且免疫原性较好的疫苗弱毒株猪霍乱沙门氏菌C500基础上构建了crp基因缺失突变株，基因缺失后毒力降低约22倍[9]。但有关S.typhimurium crp/cya基因双缺失的构建国内尚未见报道。覃宗华等从国外引进了S.typhimuriumX4550 cya/crp双突变减毒株，并研究了该菌株对鸡的致病力及其在鸡体所诱导的特异性免疫保护效果，结果表明S.typhimurium的cya/crp突变株不仅毒力明显降低，而且保留了良好的免疫原性[10]。

与随机插入转座子等传统的基因工程方法相比，由重组自杀性质粒介导的细菌等位交换进行革兰氏阳性菌和阴性菌染色体上的基因重组或突变具有重组率高、筛选方便等较多优点。本研究中使用的自杀性质粒pRE112△crp[4]含有正向选择的氯霉素(Cm)抗性基因和反向选择的蔗糖敏感基因(sacB)两种选择标记，明显提高了重组几率。但亲本株SL1344△cya与SL1344△crp△cya在含麦芽糖的麦康凯培养基上均呈无色菌落，并不易于筛选。通过长时间重复性的观察培养及加大筛选量，最终通过PCR鉴定并得出结果。筛选出的SL1344△crp△cya突变株，通过生物学特性研究表明其血清型没有发生改变，遗传稳定，毒力显著降低。在本研究中，最高接种剂量也未致雏鸡死亡，仅对其采食和精神状况有一定影响。根据结果可以推测构建的SL1344△crp△cya双缺失株对1日龄雏鸡的LD50大于1011。如果要准确测定其LD50须再提高接种剂量，因此本实验只是以最高感染剂量对鸡所引起的临床症状作为指标来评价所构建菌株的致病力。覃宗华等曾对S.typhimuriumX4550cya/crp双突变减毒株对鸡的致病力做出研究[11]，这与其报道结果几乎一致。根据Bliss法算出野生株SL1344的LD50为2.28×105，与其相比，SL1344△crp△cya减毒至少106倍，显示其具有良好的安全性，为开发S.typhimurium弱毒苗或作为外源抗原在机体内的投递系统提供了保障。

综上所述，本研究在以S.typhimuriumSL1344△cya为亲本株的基础上进一步构建了其crp基因缺失株，该双缺失株生长速度更加缓慢，毒力进一步降低，而且其遗传稳定。该菌是通过重组自杀性质粒介导细菌基因的等位交换技术构建，不含有任何抗生素抗性基因，基因背景清晰，为研制安全有效的S.typhimurium疫苗及其疫苗载体奠定了基础。

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