H5亚型禽流感病毒样颗粒的构建及生物学活性鉴定

张超林，刘春国，王寿山，石薇琳，李建辉，王 伟，刘彦云，刘 明*

(1.东北农业大学动物医学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部动物流感重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)

H5N1亚型高致病性禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)是引起禽流感暴发的主要病原，对养禽业造成了严重的经济损失。流感病毒粒子表面具有囊膜，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是病毒囊膜上的两种主要抗原，可以诱导禽类和哺乳动物产生免疫反应[1]。疫苗免疫是预防AIV感染的主要措施，目前使用的禽流感疫苗主要为传统的全病毒灭活疫苗及重组活载体疫苗[2-3]。

病毒样颗粒(Virus-like particles，VLPs)是新型流感疫苗研究的一种策略，与传统禽流感疫苗生产方法相比，该疫苗不依赖于传统的鸡胚生产系统，而采用体外细胞培养制备疫苗抗原；因其不含有病毒的基因组，因此具有更高的安全性；而且制备的VLPs与病毒粒子的天然构象相同或相似，有利于将表面糖蛋白呈递给免疫系统，从而诱导机体产生中和抗体[3]。本实验采用构建同时表达多个结构蛋白，对VLPs形成的影响进行探索，并进一步鉴定了流感VLPs的免疫原性和生物学活性，为研制新型流感亚单位疫苗奠定基础。

1 材料和方法

1.1 重组质粒和菌株 含有流感病毒A/Goose/QFY/2004(H5N1)HA基因和A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)M1基因重组质粒pHWQFY-HA和pHWPR-M1均由哈尔滨兽医研究所动物流感实验室构建。杆状病毒转移载体pFastBac Dual和pFastBac1，Sf9昆虫细胞，感受态细胞E.coliDH5α和DH10Bac由哈尔滨兽医研究所动物流感实验室保存。

1.2 主要试剂 ExTaq酶、T4 DNA连接酶和限制性内切酶均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒和小量胶回收试剂盒购自AXYGEN生物技术公司；胎牛血清和Cell Fectin转染试剂盒购自Invitrogen公司；标准预染蛋白分子量购自中国科学院上海生化所；鸡抗H5N1亚型AIV的血清，鼠抗H5N1亚型AIV HA单克隆抗体(MAb)97D2均由哈尔滨兽医研究所动物流感实验室制备；碱性磷酸酶标记的马抗鼠IgG(IgG-AP)购自北京中杉金桥生物技术有限公司；红外荧光标记羊抗鸡IgY(IgY-FITC)购自北京达科为生物技术有限公司；AP标记羊抗鸡IgG(IgG-AP)购自Sigma公司。

1.3 PCR用引物设计和目的基因的扩增 参考GenBank已发表中国大陆地区H5N1亚型AIV基因序列，用Oligo 6.0软件设计HA和M1基因的特异性引物(表1)，扩增HA、M1片段分别为1700 bp和800 bp。PCR反应程序：94℃5 min；94℃30 s、52℃30 s、72℃2 min，共30个循环；72℃10 min。参考pFastBac Dual载体设计测序用引物pFastBac-F和pFastBac-R(表1)。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 实验中PCR扩增所用的引物及其序列Table 1 Primer sequences used for the PCR amplification in the experiment

1.4 穿梭载体pFastBacDual-HA-M1和pFastBacl-HA的构建 分别以pHWQFY-HA和pHWPR-M1为模板，用设计的特异性引物扩增HA和M1片段。用限制性内切酶对扩增的片段和载体酶切处理，将HA片段分别与pFastBacDual和pFastBac1连接，获得重组质粒pFastBacDual-HA和pFastBac1-HA；用SalⅠ和NotⅠ对pFastBacDual-HA和M1片段酶切处理，连接构建重组质粒pFastBacDual-HA-M1(图1)。提取、鉴定重组质粒，并由南京金斯瑞科技有限公司测序。

图1 流感病毒结构蛋白表达构建模式图Fig.1 Constructs for expression of influenza proteins

1.5 重组杆粒的构建 按照Invitrogen公司的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明将pFastBacDual-HA-M1和pFastBac1-HA分别转化E.coliDH10Bac感受态细胞中，通过蓝白斑筛选，挑取白色菌落，提取重组杆粒，并进行PCR鉴定，将鉴定为阳性的重组杆粒分别命名为rBacmid-HA-M1和rBacmid-HA。

1.6 重组杆状病毒的制备 按照Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书进行。分别取2 μg rBacmid-HAM1和rBacmid-HA，在Cellfectin的介导下转染Sf9昆虫细胞，27℃培养4 d～5 d，观察细胞病变(CPE)，收集上清作为第一代重组病毒(P1)，以终点稀释法确定重组杆状病毒原液的滴度，将重组病毒分别命名为rBV-HA-M1和rBV-HA。

1.7 重组蛋白的表达及鉴定

1.7.1 重组蛋白的SDS-PAGE检测 将高滴度的rBV-HA-M1和rBV-HA分别接种Sf9昆虫细胞，感染72 h后收集样品细胞，以12%SDS-PAGE胶进行电泳，经考马斯亮蓝染色分析蛋白表达情况。

1.7.2 重组蛋白的western blot鉴定 样品经SDS-PAGE电泳后，将其转印至硝酸纤维素膜，用5%脱脂乳4℃封闭过夜，以鸡抗H5N1亚型AIV的阳性血清为一抗(1∶250)，以羊抗鸡IgY-FITC为二抗(1∶2500)，用红外荧光扫描仪成像。

1.7.3 VLPs的电镜观察 将P3代rBV-HA-M1和rBV-HA分别感染Sf9细胞，按常规方法收集处理样品，进行磷钨酸负染，采用透射电镜观察VLPs。

1.7.4 重组蛋白血凝滴度的测定 按照实验室常规血凝检测方法，在96孔血凝板中用1%的鸡红细胞悬液检测。室温作用30 min后，以孔内凝集红细胞不下流为终点，将该孔的稀释度表示为血凝滴度。

1.7.5 免疫组织化学法的鉴定 将P3代rBV-HAM1和rBV-HA分别以1 MOI接种于24孔板中的Sf9单层细胞，培养72 h后，采用3%福尔马林固定细胞，作用20 min；浸透液(3%福尔马林和0.5%Triton-100)作用10 min；以鼠抗H5亚型AIV HA的MAb为一抗(1∶1000)，以马抗鼠 IgG-AP 为二抗(1∶2500)，用显色液显色(NBT/BCIP)，显微镜下观察。

2 结果

2.1 重组转移载体和重组杆粒的鉴定 将构建的pFastBacDua-HA-M1重组质粒分别用AscⅠ单酶切或XhoⅠ和NheⅠ双酶切，琼脂糖凝胶电泳分析表明分别切下大小约为2300 bp和800 bp的条带；构建的pFastBac1-HA重组质粒用AscⅠ单酶切也可获得约为2300 bp的条带；用M13通用引物对重组杆粒PCR鉴定，扩增rBacmid-HA-M1和rBacmid-HA分别可以得到约为5100 bp和4300 bp的特异性条带，而阴性对照只扩增得到约为300 bp大小的条带，与理论值相符(图2)。

2.2 重组杆状病毒的制备 将构建的重组杆粒转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBv-HA-M1和rBV-HA。其病毒效价检测，P3代病毒的TCID50分别为3.16×107/mL和 3.07×107/mL。

图2 重组杆粒PCR鉴定及穿梭重组杆质粒的酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant Bacmid by PCR

2.3 重组蛋白的SDS-PAGE和western blot鉴定重组病毒感染Sf9细胞裂解物经SDS-PAGE电泳，显示在70 ku和26 ku处出现了特异性条带。用鼠抗H5N1 AIV的血清对重组蛋白进行western blot鉴定，在70 ku和26 ku处可见特异性条带(图3)。

图3 SDS-PAGE和western blot检测重组蛋白Fig.3 The SDS-PAGE and western blot analysis of the recombinant protein expressed in Sf9

2.4 VLPs的电镜观察 将获得的重组蛋白用透射电子显微镜观察，rBV-HA-M1表达的重组蛋白在电镜下可以观察到表面具有纤突的囊膜状VLPs(图4A)，而单独表达HA蛋白没有观察到VLPs(图4C)。

图4 透射电镜观察重组蛋白(Bar=100 nm)Fig.4 Morphologic observation of VLP and virus particals under transmission electron microscope

2.5 重组蛋白的免疫组织化学法检测 经免疫组织化学法检测，可以观察到被病毒感染的细胞中AIV的HA和M1蛋白获得了有效表达，呈现紫色(图5)。

图5 免疫组织化学法检测重组蛋白Fig.5 Immunohistochemical detection of the recombinant protein

2.6 重组蛋白的血凝滴度测定 将rBV-HA-M1和rBV-HA分别以10 MOI感染Sf9细胞，72 h后细胞进行超声破碎，收集上清进行血凝实验，结果显示rBV-HA和rBV-HA-M1表达的重组蛋白的血凝价分别为 1∶27和 1∶28。

3 讨论

目前，流感病毒H1N1、H3N2、H5N1、H5N3、H7N1及H9N2等亚型中均有关于VLPs的报道[4-9]。研究显示VLPs能够有效的诱导保护性免疫反应[4,6]，诱导抗HA抗体的能力与弱毒疫苗相似或更高[5]。Quan等研究显示H1N1 VLPs免疫小鼠能够抵抗同源和异源流感病毒的攻击。一系列研究表明流感VLPs是替代现有疫苗的最佳候选者[7]。

本研究通过昆虫细胞表达AIV结构蛋白，结果显示单独表达HA蛋白或共表达HA和M1蛋白均具有较高的血凝活性，表明通过昆虫细胞获得的HA蛋白具有天然活性。电镜观察发现，共表达的HA和M1蛋白可以明显的观察到流感VLPs的存在；张树梅等研究表明将HA，NA和M1基因构建在于不同的启动子之下在哺乳动物细胞中共表达，在透射电子显微镜可以观察到VLPs[8]，与本实验的结果一致。Gary等的研究显示单独表达HA蛋白可以形成VLPs[9]，而本研究的结果却与之相反。

HA含有流感病毒的重要抗原表位，在疫苗的生产中，高滴度的HA特异性抗体是流感疫苗产生保护性免疫的关键[9-11]，张晓霁等的研究也显示AIV HA是激发保护性免疫反应的主要蛋白[11]。在本实验中，将HA基因插入PPH启动子之下，将M1基因插入P10启动子之下，其表达的HA蛋白比M1蛋白所占的比例高，表明在VLPs形成中，可以根据不同蛋白的比例选择不同的启动子进行表达。本实验中表达的重组蛋白能够与鼠抗H5N1亚型AIV血清发生特异性反应，表明通过该方法制备的禽流感VLPs具有良好的生物学活性，该方法为流感病毒的生物学特性研究提供了有力的工具，同时这种制备VLPs的方法在AIV亚单位疫苗的研制中有着良好的应用前景。

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