疏肝补肾法对睡眠剥夺大鼠学习记忆及前额叶皮质BDNF蛋白表达的影响

冯婷 李峰 宋月晗 刘晓兰 马捷 毛萌 吴凤芝 刘晶

睡眠的作用是调节丘脑—皮层以及海马—新皮质网络神经元之间同步化作用，可以根据神经元的活动性来促进不同程度的突触效应，将短时记忆碎片再次激活、分析，并逐渐组合，融合成长时程记忆。不同时间的睡眠剥夺对学习记忆有不同程度的影响，对动物进行中长期睡眠剥夺能显著造成学习记忆障碍，脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)作为第二个被发现的神经营养因子也参与长时程增强的产生和维持。本实验通过疏肝补肾方药干预睡眠剥夺造成学习记忆障碍，观察BDNF的蛋白表达，研究疏肝补肾法的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

成年雄性SD大鼠36只，清洁级，体重(270±20)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号为SCXK(京)2006-0009。饲养于室内温度(22±2)℃、相对湿度在30%～40%的动物房，光照节律12L∶12D(6∶00～18∶00)，适应性饲养3天，期间自由饮水、进食，同时进行站平台训练。随机将大鼠分为3组，每组12只，分别为对照组(正常环境饲养)、模型组(睡眠剥夺)、疏肝补肾治疗组(模型组基础上给予四逆散和生慧汤合方)。

1.2 动物模型制备

采用改良的多平台(MMPM)睡眠剥夺法[1]复制模型，将模型组和疏肝补肾治疗组从造模第1天早8∶00开始放入睡眠剥夺箱，连续7天，至第8天早8∶00结束。使用自制睡眠剥夺箱，规格110 cm(长)×60 cm(宽)×40 cm(高)，塑料箱内壁为灰色，其底面均匀固定15个直径6.5 cm、高8 cm的有机玻璃平台。造模开始前在箱内注水，水平面应在平台下1 cm处，水温保持在28～30℃。箱顶置铁丝网，大鼠在平台间可自由活动和饮食。

1.3 药物制备与给药方法

疏肝补肾治疗组采用四逆散和生慧汤的1∶1合方。四逆散：选用《伤寒论》的四逆散(由柴胡、枳实、赤芍、炙甘草各6 g组成)；生慧汤：选用《辨证录·健忘门》的生慧汤(由熟地黄30 g、远志6 g、山茱萸12 g、柏子仁15 g、菖蒲1.5 g、炒枣仁15 g、茯苓9 g、红参9 g、白芥子6 g组成)。方药均为北京中医药大学东直门医院提供的免煎颗粒(北京康仁堂药业有限公司生产)，按人体用药量换成大鼠等效剂量作为大鼠用药量，每天给予生药量为13.38 g/kg，灌胃容积1 ml/kg，时间点为睡眠剥夺的4、28、52、76、100、124、148小时。对照组和模型组同时间给予等体积蒸馏水。

1.4 试剂

抗原修复液(北京普利莱基因技术有限公司)，ABC试剂盒(VECTOR公司，美国)，BDNF兔来源多克隆抗体(Abcam公司，美国)，DAB试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成科技有限公司)。

1.5 学习记忆评定

采用Y迷宫评定大鼠的记忆能力。各组造模前3天进行每天20次的训练，取第3天成绩，造模最后一天再进行测试。设备由三等分迷路箱和控制仪组成。迷路箱为等长的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ臂和三者的交界区；箱底铺设间距1 cm的电栅，每臂顶端各装一盏15 W的刺激信号灯。Y迷宫的控制仪有电压控制按钮、延时控制按钮和Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、0四个按钮，当分别按下Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ按钮时，相应臂的信号灯亮，此时该臂不通电为安全区，另外无灯光的两臂及交界区均通电而成为非安全区；按下0按钮，则三臂均不通电，但交界区通电，信号灯亮后，稍停片刻电栅才开始通电[2]。根据文献研究，本实验采用“固定次数随机不休息法”[3]，实验时先将大鼠放入迷宫适应3分钟，然后无规则变换安全区次序，大鼠受电击后逃到安全区，灯光持续10秒，然后再以所在臂作为下次测试的起始位置进行下一次测试。每个实验日连续测试20次，连续10次中有9次或者以上正确反应，则为达标。本实验每组筛选出9只进行测试。所用参数：电压50～70 V，延时5秒。

1.6 血清SOD检测

造模结束后，用10%水合氯醛溶液以0.3 ml/100 g体重腹腔麻醉，断头取血，置于冰上，使用4℃低温离心机以3000转/分离心15分钟，取得上清置于Eppendorf管中﹐保存于-20℃冰箱待用。采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活力。每组选取9只离心效果好的血清进行检测。

1.7 前额叶皮质区BDNF蛋白检测

1.7.1 组织切片 造模结束麻醉后，于冰上取每组半数大鼠的全脑，去除嗅球及小脑后，用液氮迅速冷冻，待脑组织变白置于-80℃冰箱待用。从-80℃冰箱取出组织，在-20℃冰冻切片机内进行组织切片，参考脑部定位图谱在前额叶皮质区连续切片，厚度为8 μm，贴于载玻片，在混合固定液[4]中固定切片5分钟后放置于-20℃冰箱待用。

1.7.2 免疫组化检测 从-20℃冰箱取出冰冻切片，室温平衡2分钟，按照说明采用微波热修复法置于抗原修复液(1∶100)中进行修复，待修复液自然冷却至室气温，将玻片取出，PBS漂洗3分钟×3次，去离子水冲洗；以0.3% H2O2去除内源性过氧化物酶(室温、避光、30分钟)，PBS漂洗5分钟×3次；羊血清封闭(3∶200、37℃、30分钟)；倾去多余血清，滴加BDNF兔来源的多克隆一抗(1∶60、4℃过夜)，PBS漂洗5分钟×3次；滴加二抗(1∶200,37℃，45分钟)，PBS漂洗5分钟×3次；滴加A、B液(1∶100，37℃，45分钟),PBS漂洗5分钟×3次；DAB显色(1∶20)，显色过程中可一边观察脑片阳性物质的显色情况，最后进行上行酒精脱水、二甲苯透明，封片，镜下观察、照相，每组随机抽取3只大鼠，每只大鼠每个部位9个视野，应用NIS-Elements BR 3.1软件进行图像分析，结果以平均光密度值表示蛋白表达相对量。

1.8 数据统计

2 结果

2.1 Y迷宫测试结果

Y迷宫结果显示，造模前最后一次各组间错误反应次数和主动回避率基本无差异。造模第7天，从错误反应次数显示，与对照组比较，模型组明显增多，有非常显著差异(P<0.01)，疏肝补肾治疗组也多于对照组，有显著差异(P<0.05)；与模型组比较，疏肝补肾治疗组的错误反应次数明显减少(P<0.01)。主动回避率结果显示，与对照组比较，模型组降低，具有非常显著差异(P<0.01)；与模型组比较，疏肝补肾治疗组增多，差异非常显著(P<0.01)。说明睡眠剥夺对机体产生明显的学习记忆力障碍，疏肝补肾方药可调节学习记忆能力。见表1。

表1 各组大鼠造模第0、7天测试结果

注：与对照组比较，aP<0.01；与对照组比较，bP<0.05；与模型组比较，cP<0.01。

2.2 血清SOD含量

结果显示，与对照组比较，模型组SOD的含量减少，差异非常显著(P<0.01)；与模型组比较，疏肝补肾治疗组SOD含量明显增多，差异非常显著(P<0.01)。说明睡眠剥夺后机体的SOD不能有效的消除应激产生的氧自由基，机体组织细胞损伤明显加重，而疏肝补肾中药能显著增多SOD的含量。见表2。

表2 各组大鼠血清学指标的对比

注：与对照组比较，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.01。

2.3 前额叶皮质BDNF蛋白表达变化

在冰冻切片进行免疫组织化学检测中，BDNF阳性反应物呈圆形、软圆形或梭形颗粒，染色为棕黄色，分布在胞浆中，所有阴性对照切片均无特异性着色。比较BDNF阳性反应物平均密度值，模型和疏肝补肾治疗组与对照组相比明显减少，具非常显著差异(P<0.01)；与模型组比较，疏肝补肾治疗组阳性反应物增多，具有非常显著差异(P<0.01)。说明睡眠剥夺减少BDNF在前额叶皮质的蛋白表达，而疏肝补肾治疗组能显著调节BDNF的减少趋势。见表3、图1。

表3 大鼠前额叶皮质BDNF免疫阳性反应物的变化

注：与对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.01

图1 各组冰冻切片大鼠前额叶皮质BDNF表达

3 讨论

BDNF广泛存在于脑的各个区域，以大脑皮层和海马居多。在成年中枢系统，BDNF的表达受一系列因素的调节，也表现为以活动依赖性的方式。它是一个重要的能够调节突触可塑性，从而影响学习记忆的中介[5]，BDNF依赖性信号传导途径通过活化TrkB受体，使水解磷脂酶C、磷脂酰环己六醇激酶-3、细胞外信号调节激酶、促细胞分裂活性蛋白激酶等的信号通路激活，通过细胞内Ca2+发挥作用，且也调节BDNF、TrkB mRNA的转化和蛋白向树突的运输，这些机制是负责蛋白翻译并调节突触传递和突触形成，从而增强和维持学习记忆功能[6]。Mizun等[7]实验提出BDNF-TrkB信号通路与N-甲基-D-天冬氨酸(NDMA)受体存有内在联系，这种联系在海马空间记忆中起到了重要作用。

实验结果证明，与对照组比较，模型组Y迷宫成绩下降，血清SOD水平降低，前额叶皮质BDNF免疫阳性物质表达显著减少，说明中长期睡眠剥夺能造成脑损伤，有可能通过BDNF介导的神经通路影响突触可塑性；经过疏肝补肾方药的干预，与模型组比较，SOD增多，氧自由基对脑功能损伤的趋势减弱，Y迷宫学习成绩提高，同时BDNF在前额叶皮质的表达上调，说明同时应用疏肝法和补肾法能调节机体的代谢状态，保护脑功能，并通过诱发长时程增强增强学习记忆能力。在以往的研究中，多采用安神、补脑、补肾、益气的方法改善睡眠剥夺等应激后所致的学习记忆能力障碍，本研究考虑到，睡眠剥夺作为一种目前生活中常见的应激方式，肝主疏泄功能的影响贯穿整个造模过程中，可以认为是一种主要的影响因素，所以本实验设计运用疏肝、补肾结合的方法观察大鼠学习记忆能力的改善。

睡眠剥夺模型模拟的是“想睡而不能睡”的病因病理过程，大鼠在睡眠剥夺箱内虽然可以自由活动、饮食，因受水的刺激，欲逃窜的心理很明显，在笔者相关试验中也发现，大鼠在睡眠剥夺期间的攻击性增强。根据中医理论，肝主疏泄、调畅气机，“所欲不得”，气血运行不畅，诸阳气会诸于头，气机失调则脑失濡养而影响神经相关功能，所以通过疏肝调畅气机，肝肾同源，又肾主骨生髓，脑为髓海，疏肝的同时予以补肾，则髓海充养，学习记忆功能增强。

针对实验所复制的造模方法，本研究首先选用《伤寒论》中的四逆散以疏肝郁、调畅气机，正如《素问·四时刺逆从论》所述“血气上逆，令人善忘”，陈士铎在《辨证录》中所说“气郁不舒，忽忽如有所失，目前之事竟不记忆，乃肝气之滞”，并结合具有补肾养心作用的生慧汤，通过肝、心、肾的交互作用，说明睡眠剥夺过程及造成学习记忆障碍的证候。应用疏肝补肾方药调节大鼠的学习记忆功能，影响BDNF的分布和表达，该通路其他递质、受体是否也参与对LTP的调节，待后续研究。

参考文献

[1] Machado RB, Hipólide DC, Benedito-Silva AA, et a1. Sleep deprivation induced by the modified multiple platform technique：quantification of sleep loss and recovery[J]. Brain Research, 2004, 1004(1-2):45-51.

[2] 王跃春,王子栋,孙黎明,等.动物学习记忆能力的Y-型迷宫测试法[J].暨南大学学报(自然科学与医学版),2001,22(5):137-140.

[3] 王秀利,唐洪丽,索国玲.癫痫持续状态对发育期大鼠学习记忆及海马磷酸化的CAMP反应元件结合蛋白表达的影响[J].实用儿科临床杂志,2007,22(22):1723-1725.

[4] 邱前程,卢善明,黄杰雄,等.不同固定剂对冰冻切片免疫组化结果的影响[J].分子诊断与治疗杂志,2009,1(4):250-252.

[5] Musumeci G, Sciarretta C, Rodríguez-Moreno A, et al. TrkB Modulates Fear Learning and Amygdalar Synaptic Plasticity by Specific Docking Sites[J].J Neurosci,2009,29(32):10131-10143.

[6] Poulin B, Butcher A, McWilliams P, et al. The M3-muscarinic receptor regulates earning and memory in a receptor phosphorylation/arrestin-dependent manner[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2010,107(20):9440-9445.

[7] Angelucci F, Mathé AA, Aloe L. Neurotrophic factors and CNS disorders: findings in rodent models of depression and schizophrenia[J].Pro Brain Res,2004,146(3)：151-165.