白花泡桐尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶mRNA全序列克隆及序列分析

熊治国，刘志刚，李建祥，裴海朝，高福玲，秦采风，陈占宽，叶金山，付 晓

(1.河南省绿士达林业新技术研究所，河南郑州450008;2.河南省经济林和林木种苗工作站，河南郑州450008;3.国家林业局泡桐研究开发中心，河南 郑州450003;4.新安县林业局，河南 新安471800)

白花泡桐(Paulownia fortunei(Seem.)Hemsl.)，是一种速生优质用材落叶树种，生长快，成材早，繁殖容易，材质好，用途广，经济价值高.木材的材质是由其组分纤维素、木质素等的结构、性质及二者的总量和比率决定的［1］.尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶 (UDP-Glucose Pyrophosphorylase，UGPase)，催化葡萄糖－1－磷酸(Glc-1-P)生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-GLC).尿苷二磷酸葡萄糖是纤维素生物合成的基本原料与前体［2］.UGP的活性决定着木材中纤维素含量及其与木质素的比率.目前，有些研究者已从一些植物如水稻［3］、黄芪［4］、大麦［5］、马铃薯［6］等中克隆了 UGPase.登录 GenBanK的泡桐mRNA只有8个，且无一与泡桐纤维素、木质素生物合成有关.这意味着目前研究泡桐纤维素生物合成代谢的表达调控尚无基础，搞清这些基因的结构、序列是研究泡桐纤维素生物合成代谢的基础与前提.本研究在对其他物种相关基因序列分析的基础上，采用RT-PCR及RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法，克隆并分析了UGP mRNA全序列，旨在丰富白花泡桐基因资源，为植物品质或材质改良提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白花泡桐由河南农业大学提供.RNA提取试剂盒、AMV逆转录酶、高保真LA Taq、相关限制性核酸内切酶等试剂从宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)购得.

1.2 试验方法

1.2.1 白花泡桐总RNA的提取 取20 cm长的生长旺盛的当年生幼嫩白花泡桐枝条，剥去韧皮部，用清洁刀片刮取木质部外周形成层部分的细胞，液氮研磨成粉，加入试剂 RNAiso Reagent(TAKARA)提取总RNA.

1.2.2 UGP部分片段的获得 (1)RT-PCR:以提取的总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用TAKARA生产的反转录酶XL(Reverse Transcriptase XL AMV)反转录得到cDNA.根据NCBI上发表的其他物种UGPase氨基酸的保守序列设计引物［7］BUF(5'－AARGAYGGNTGGTAYCCNCCNGG－3')和BUR(5'－GGRTTNGGDATDATYTCCATYTT－3')，cDNA为模板，TAKARA高保真Taq LA进行RTPCR，扩增UGP部分序列.反应结束后于琼脂糖凝胶中电泳检测结果.(2)序列测定:凝胶回收试剂盒回收目的片段.回收后的PCR产物送宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)进行序列测定.

1.2.3 UGP mRNA 5'上游未知序列的获得 使用TAKARA出品的5'-FULL RACE kit(Code No:D315)来克隆5'上游未知序列.依据获得的白花泡桐UGP部分编码序列，优选了2条特异的嵌套式PCR引物 U.5GSP1(5'－TGATTGCCTGTAAGTTGACCC－3')和 U.5GSP2(5'－GACATATTCTTTGCCCTGCGATA－3').克隆程序包括:1)泡桐总RNA的提取;2)泡桐总RNA去磷酸化处理;3)去帽子反应;4)5'RACE接头的连接;5)反转录反应;6)以外侧的特异性引物U.5GSP1与5'RACE Outer(5'－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT－3')引物进行PCR反应;7)以内侧的特异性引物U.5GSP2与5’RACE Inner(5'－ CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG－3')引物进行PCR反应.琼脂糖凝胶电泳检测结果.凝胶回收扩增的片段，克隆于pMD20-T载体，转化E.coli JM109，菌落PCR鉴定的阳性克隆送样测序.

1.2.4 UGP mRNA 3'下游未知序列的获得 使用TAKARA 出品的3'－FULL RACE Core Set Ver.20(Code No:D314)来克隆3'下游未知序列.依据获得的白花泡桐UGP部分编码序列，优选了2条特异的嵌套式PCR引物U.3GSP1(5'－TTGTTATCGCAGGGCAAAG －3')和 U.3GSP2(5'－ACACTAGCTGATGTGAAAGGTGGT－3').具体的克隆程序包括:1)泡桐总RNA的提取;2)套式PCR反应，先以外侧的特异性引物U.3GSP1与3'RACE Outer(5'－TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT－3')引物，进行PCR反应，再以内侧的特异性引物U.3GSP2与3'RACE Innerer(5'－CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG－3')引物进行 PCR反应.琼脂糖凝胶电泳检测结果.凝胶回收扩增的片段，克隆于pMD20－T载体，转化 E.coli JM109，菌落PCR鉴定的阳性克隆送样测序.

1.2.5 UGP mRNA全序列的获得及分析 经过以上步骤，分别获得了UGP mRNA的部分序列、5'上游未知序列、3'下游未知序列，且3个序列互有重叠，经Lasergene软件拼接、分析，得到UGP mRNA全序列，提交GenBank.

2 结果与分析

2.1 白花泡桐部分序列的获得

提取白花泡桐的总RNA，经电泳检测其浓度，反转录后以 BUF，BUR为引物，TAKARA高保真Taq LA RT-PCR，电泳结果见图1.将此片段回收，插入pMD19-T vector、转化，挑单菌落鉴定、测序.测序知扩增片段长413 bp，与预期相符.以此DNA片段序列推测可编码137个氨基酸，将其基因序列与NCBI中其它植物的UGPase进行比对，与烟草、马铃薯的UGP序列同源性分别为85%，84%.因此根据相似度可以断定此扩增的片段即为泡桐UGP基因的部分mRNA序列.

图1 UGP RT-PCR电泳图Fig.1 The UGP of RT-PCR

2.2 UGP mRNA 5'上游未知序列的获得

RACE法得到UGP mRNA 5'上游片段，经琼脂糖凝胶电泳检测结果.凝胶回收扩增的片段，克隆于pMD20-T载体，转化E.coli JM109，菌落PCR鉴定的阳性克隆送样测序，测序结果参见图2.序列中有效序列长777 bp.

2.3 UGP mRNA 3'下游未知序列的获得

RACE法得到UGP mRNA 3'上游片段，经琼脂糖凝胶电泳检测结果.凝胶回收扩增的片段，克隆于pMD20-T载体，转化E.coli JM109，菌落PCR鉴定的阳性克隆送样测序，测序结果见图2.序列中有效序列长815 bp.

2.4 UGP mRNA全序列的获得及分析

使用Lasergene软件，得到UGP mRNA全序列，见图3.UGP mRNA共1 694个碱基，CDS共1 428个碱基(112～1 539)，编码氨基酸475(图3).

图2 白花泡桐UGP mRNA全序列Fig.2 The complete sequence of UGP mRNA

登陆NCBI网站，利用GenBank BLAST软件对泡桐UGP全长mRNA序列分析比对的结果显示，与烟草的同源性为84%，与马铃薯的同源性为83%，美洲山杨的同源性为 81%.利用 GenBank BLAST软件对泡桐UGP酶氨基酸序列分析比对的结果显示，与烟草相似性为89%，与美洲山杨的相似性为88%，与马铃薯的相似性为88%.

图3 白花泡桐UGP氨基酸全序列Fig.3 The amino acid sequence alignment of UGP

3 讨论

虽然UGP基因已从水稻、黄芪、大麦、马铃薯等几种植物中克隆出来，但用BLAST比较了已知的几种植物的UGP基因核苷酸序列，由于亲缘关系较远，很难找到可用来设计引物的同源性很高的核苷酸片段，只能依据UGP氨基酸保守序列，设计简并引物，通过RT-PCR扩增得到一段cDNA片段，以此片段序列为基础设计特异引物，再通过5'RACE扩增得到了含5'末端的cDNA片段，3'RACE扩增得到含3'末端的cDNA片段.根据以上2个片段的核苷酸序列，设计特异引物，扩增得到了包含完整编码区的全长cDNA.为提高PCR扩增的特异性，采用嵌套PCR扩增.由嵌套引物引导的第2轮PCR可显著提高扩增产物的特异性.RACE是1种以PCR为基础快速分离包含3'和5'末端的cDNA的方法.其优点在于快速简便，仅知少量序列信息时即可扩增得到全长cDNA，多数情况下无需构建cDNA文库.我们在仅知UGP部分氨基酸序列的情况下，未构建cDNA文库，应用RACE这种方法，首次得到了白花泡桐UGP全长cDNA.

对于植物UGPase是否存在多基因家族的问题，早期研究者认为植物中只有1种UGPase，EIMERT等从大麦叶、胚及胚乳的cDNA文库中克隆了11个UGPase序列，结果也表明大麦中只有1种UGPase［5］.但后来的研究发现在马铃薯［8，9］、水稻［3］中存在2种相似性很高的UGPase.水稻中存在2种UGPase，其中UGP1位于第9条染色体上，而UGP2位于第2条染色体上.而白花泡桐中是否也存在2种UGPase，还有待进一步研究.

本研究首次克隆了白花泡桐UGP mRNA全序列，构建载体的后续工作正在进行中.希望通过抑制纤维素生物合成的关键酶UGPASE的活性，以此提高木质素的比率，从而提高泡桐木材的硬度.

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