高效液相色谱法同时测定食品中8种合成着色剂

杨 岚，张敬轩，李 强，吴春敏，李建文

（河北省食品质量监督检验研究院，河北省食品安全重点实验室，河北 石家庄 050091）

人工合成着色剂被广泛应用于饮料、雪糕、糖果、糕点、蜜饯、果冻、果酱、调料、火腿、罐头等食品。人工合成着色剂属于偶氮染料，具有一定毒性，若使用不当会危害人体健康，我国对其在食品中的使用有严格限制与规定，多种合成着色剂已被禁止或严格限量使用［1］。但是，在经济利益驱使下，我国食品中人工合成着色剂的超标、超范围使用现象屡禁不止，因此，建立快速、准确、灵敏的人工合成着色剂检测方法势在必行。目前国家标准方法中的高效液相色谱法［2］是较好的检测方法，但其推荐的样品前处理技术是色素的吸附与解吸附方法，步骤繁琐，易造成损失［3］。本文采用快速液相色谱、DAD多波长检测法，不仅缩短了检测时间，提高了灵敏度，扩大了检测范围，而且大大简化了前处理方法［4］。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柠檬黄、日落黄（中国计量科学研究院）；苋菜红、胭脂红、亮蓝（国家标准物质研究中心）；诱惑红、赤藓红（天津市卫生防病中心研制）；甲醇为色谱纯；乙酸铵为优级纯；乙醇、氨水均为分析纯。

乙醇－氨水溶液：将80mL乙醇和1mL的氨水加超纯水定容于100mL的容量瓶配置而成。

8种着色剂混合标准贮备溶液：100μg／mL。准确量取适量的每种着色剂标准溶液，用水稀释成100 μg／mL的8种着色剂混合标准中间溶液（4℃保存，有效期1个月）。

样品（果汁、果味饮料、山楂糕、方便面、饼干、挂面）均为市场销售的实际样品。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100高效液相色谱（美国Agilent公司）；内附自动进样器、二元泵、二极管阵列检测器（DAD）；RT15T高速冷冻离心机（上海天美公司）；AB 265十万分之一分析天平（法国Mettler公司）；超声波清洗器（KQ－250pv）；移液器（200μL，1mL，5mL）；一次性注射式滤器（配有0.22μm微孔滤膜）。

1.3 色谱条件

色谱柱：Warters－C18，（4.6mm×250mm，5μm）；流动相梯度洗脱条件见表1，其中A为甲醇；B为10mmol乙酸铵（加入200μl冰乙酸）；流速：1.00mL／min；进样量：10.00μL；柱温：室温。以甲醇－乙酸铵水溶液为流动相。

表1 梯度洗脱程序

1.4 标准曲线方程的确定

将8种着色剂标准溶液分别稀释为1.00μg／mL、2.00μg／mL、4.00μg／mL、6.00μg／mL、8.00μg／mL、10.0μg／mL、20.0μg／mL、30.00μg／mL、40.00μg／mL、50.00μg／mL，并在上述色谱条件下测定，得到各自的标准曲线方程。

1.5 样品前处理

选取6个有代表性的样品：果汁、果味饮料、山楂糕、方便面、饼干、挂面。

称取1.0g左右固体样品于10mL离心管中，加5ml乙醇－氨水－水溶液，超声提取30min，15000r／min离心10min，上清液经0.22μm有机膜过滤后，供HPLC测定。

吸取1mL液体样品于10mL离心管中，加4mL乙醇－氨水－水溶液，超声提取30min，15000r／min离心10min，上清液经0.22μm有机膜过滤后，供HPLC测定。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的选择

以甲醇和乙酸铵溶液为流动相，比较了不同浓度配比、不同pH、不同梯度洗脱的各种条件下考察了各种因素对于目标化合物的分离度、峰形的影响。最终采用如表1所示梯度洗脱程序效果最好，在该条件下分离8种质量浓度均为50mg／L的混合标准品，色谱图见图1。

图1 8种标品在质量浓度为50mg／L时的分离色谱图

2.2 检测波长的选择

使用DAD检测器分别对柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝、酸性橙、赤藓红进行光谱扫描，根据所得光谱图可知，大部分合成着色剂在低于250nm处都有较大吸收，但低波长区域往往会有其它物质的干扰，因此选择254nm为检测波长，但是，亮蓝在254nm处吸收低，因此，同时采用其最大吸收波长629 nm作为亮蓝的检测波长。最终确定柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、酸性橙、赤藓红的检测波长为254nm。亮蓝的检测波长为629nm。

2.3 样品前处理条件的选择

合成着色剂属于水溶性化合物，因此提取溶剂应该使用极性较强的有机溶剂和水混合溶剂。通过对样品使用水及不同比例乙醇－氨水水溶液提取测定后发现，当乙醇∶氨水∶水比例为80∶1∶19时，提取效率较高，而且减少了有机溶剂的用量，最终确定乙醇∶氨水∶水比例为（80∶1∶19）水溶液为提取溶剂。

2.4 标准曲线的绘制

分别移取标准储备液进行逐级稀释，并配制成一系列质量浓度的标准混合液，在所选定的色谱条件下，以峰面积对质量浓度绘制成标准曲线。方法的检出限以RSN＝3计算。各组分标准曲线的线性方程、相关系数及检出限见表2。从结果可以看出，线性相关系数均大于0.998，方法检出限介于0.0502～0.6119μg／mL之间。

表2 方法线性方程和检出限

2.5 精密度和回收率实验

取山楂空白样品作为平行试样进行加标回收率实验，分别添加2个水平的等量混合标准溶液，按1.5节处理进行回收率实验，每个水平做6个平行，8种合成着色剂的回收率范围在85.4%～99.3%之间，RSD范围在1.36%～3.89%之间。实验的加标回收率及精密度见表3。

表3 加标回收率实验结果

2.6 验证试验

本方法用于市场销售的实际样品（果汁、果味饮料、山楂糕、方便面、饼干、挂面）测定，结果见图2。结果显示果味饮料中含有日落黄着色剂，挂面中含有柠檬黄和赤藓红着色剂，果汁、山楂糕、方便面、饼干中均未检测出含有这8种着色剂。

果汁

果味饮料

山楂糕

方便面

图2 实际样品测定色谱图

3 结论

上述结果表明，该方法快速、准确，灵敏度高、精密度好、准确度高。8种合成着色剂的检出限为0.0502～0.6119μg／mL，加标回收率范围在85.4%～99.3% 之间，RSD（n＝6）范围在1.36%～3.89% 之间。该方法不需浓缩、前处理简便、试剂用量少，采用254nm、629nm为检测波长，干扰物质少，从样品处理到上机测定仅需2h即可完成，符合现代分析技术的发展趋势。

［1］ 姚焕章.食品添加剂［M］.北京：中国物资出版社，2001.

［2］ GB／T5009.35－2003食品中合成着色素剂的测定［S］.北京：中国标准出版社，2003.

［3］ 李娜.快速液相色谱法测定食品中11种合成着色剂［J］.食品工业科技，2009，30（1）：313－325.

［4］ 沈小婉.色谱法在食品分析中的应用 ［M］.北京：北京大学出版社，1992.