基质金属蛋白酶-9在人脑胶质瘤中的表达及意义

王 毅，刘志红，焦保华，陈永汉，张 刚

（1.河北省沧州市中心医院神经外二科，河北沧州 061000；2.河北医科大学第二医院内分泌科，

河北石家庄 050000；3.河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄 050000）

基质金属蛋白酶-9在人脑胶质瘤中的表达及意义

王 毅1，刘志红2，焦保华3，陈永汉1，张 刚1

（1.河北省沧州市中心医院神经外二科，河北沧州 061000；2.河北医科大学第二医院内分泌科，

河北石家庄 050000；3.河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄 050000）

目的探讨基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinases，MMP-9）与脑胶质瘤发生发展的关系。方法以52例人脑胶质瘤组织标本作为研究对象，采用免疫组织化学方法检测MMP-9的表达，并应用原位杂交技术检测MMP-9 mRNA在人脑胶质瘤中的表达情况。结果MMP-9、MMP-9 mRNA的表达水平与肿瘤的分级呈正相关（r=0.925，P均＜0.01）。结论MMP-9在脑胶质瘤发生发展中具有重要作用，MMP-9可能与判断预后有关。

基质金属蛋白酶类；神经胶质瘤；免疫组织化学

恶性脑胶质瘤的主要特征是向周围正常组织浸润和转移。这一特征使得恶性脑胶质瘤的手术全切和局部治疗困难，同时也是肿瘤术后复发和（或）再发的主要原因之一。因此，了解肿瘤细胞的浸润和转移机制十分必要。研究发现，这一过程涉及肿瘤细胞黏附、基质降解、细胞迁移等许多环节。细胞外基质在肿瘤的浸润和侵袭过程中起着关键作用。而细胞外基质的降解主要是依靠蛋白水解酶。基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMPs）是蛋白水解酶中较为重要的一类，它们通过对ECM的降解促进肿瘤细胞向周围组织侵袭。本研究采用免疫组织化学和原位杂交技术，检测MMP-9和MMP-9 mRNA在52例人脑胶质瘤中的表达，以探讨其活性与脑胶质瘤侵袭性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：我院神经外科2008年3月—2010年5月手术切除且保存完好的胶质瘤组织石蜡包埋标本52例，临床资料完整，男性28例，女性24例，年龄7～78岁，平均42.7岁。脑胶质瘤组织学分型根据2000年修改的WHO神经系统肿瘤分级标准对其进行分类分级，其中Ⅰ～Ⅱ级（星形细胞瘤）25例，Ⅲ级（间变性星形细胞瘤）17例，Ⅳ级（多形性胶质母细胞瘤）10例，所有患者术前均未进行放疗与化疗。

1.2 组织标本的制备：取手术中切除的新鲜脑胶质瘤样本，去除血凝块、坏死及电灼组织，用生理盐水冲洗后迅速置于4%多聚甲醛中固定，2h后常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋。连续切片5～6张，厚度4μm，用涂有APES载玻片贴片，60℃烘烤72h，行免疫组织化学染色和原位杂交。

1.3 试剂与方法：MMP-9单克隆抗体由武汉博士德公司提供，PV6001二抗试剂盒及浓缩型DAB试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供，原位杂交试剂盒由武汉博士德公司提供。采用免疫组织化学PV法检测基质金属蛋白酶-9在脑膜瘤中的表达，实验步骤严格按试剂盒说明书进行。采用原位杂交方法检测MMP-9 mRNA的表达，实验步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4 阳性结果判定：MMP-9免疫组织化学染色位于细胞胞浆，极少数有胞核着色，光镜下呈棕黄色或棕褐色，在400倍光镜下至少观察5个视野，肿瘤阳性细胞≥5%为阳性表达，＜5%为阴性表达。MMP-9 mRNA原位杂交细胞胞浆着色呈棕黄色为阳性。以高倍视野（×400）下阳性细胞数量综合判断，采用半定量分析法。每张切片随机选择5个以上高倍视野，镜下视野清晰，无坏死、出血，计算1 000个肿瘤细胞的阳性率。每张切片计数1 000个肿瘤细胞，求出蛋白表达阳性细胞百分数，用标记指数（labeling index，LI）表示，LI=阳性细胞数/计数细胞数×100%；mRNA表达阳性细胞百分数也用LI表示。

图1 MMP-9在Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤中的表达（免疫组织化学pv法×400）Figure 1 Expression ofMMP-9 in gradeⅠ～Ⅱglioma（IHC×400）

1.5 统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行分析，计量资料以¯x±s表示，组间比较采用单因素方差分析并作两两比较的q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MMP-9在脑胶质瘤中的表达结果：MMP-9免疫组织化学阳性染色在胞核和胞浆中均有表达，但以胞浆着色为主，阳性细胞胞浆呈棕黄色或棕褐色（图1～3）。低级别组（Ⅰ～Ⅱ级）胶质瘤中MMP-9的LI是0.114 3±0.020 7；Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中MMP-9的LI分别是0.230 5±0.124 7、0.358 2±0.115 3。MMP-9的表达在胶质瘤各级间差异有统计学意义（P＜0.01）。MMP-9蛋白与胶质瘤病理分级呈显示正相关（r=0.925，P＜0.01），随胶质瘤级别增高，MMP-9蛋白阳性表达升高。

图2 MMP-9在Ⅲ级胶质瘤中的表达（免疫组织化学pv法×400）Figure 2 Expression ofMMP-9 in gradeⅢglioma（IHC×400）

图3 MMP-9在Ⅳ级胶质瘤中的表达（免疫组织化学pv法×400）Figure 3 Expression of MMP-9 in gradeⅣglioma（IHC×400）

2.2 脑胶质瘤中MMP-9 mRNA表达情况：MMP -9 mRNA原位杂交呈棕黄色颗粒或棕褐色颗粒，着色于胞浆中及少量胞核中，呈棕黄色（图4～6）。MMP-9 mRNA表达与MMP-9表达检测结果基本一致。肿瘤组织中可见MMP-9 mRNA阳性染色。低级别组（Ⅰ～Ⅱ级）胶质瘤中MMP-9 mRNA的RI是0.1035±0.0207；Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中MMP-9 mRNA的LI分别是0.2012±0.1084、0.4017± 0.1153。MMP-9 mRNA在胶质瘤各组阳性表达率明显高于正常脑组织，差异均有统计学意义（P＜0.01）；胶质瘤各级间差异均有统计学意义（P＜0.01）。MMP-9 mRNA与胶质瘤病理分级存在显著正相关性（r=0.938，P＜0.01），随胶质瘤级别增高，MMP-9 mRNA阳性表达升高。

图4 MMP-9 mRNA在Ⅰ-Ⅱ级胶质瘤中的表达（原位杂交法×400）Figure4 Expression of MMP-9 mRNA in gradeⅠ～Ⅱglioma（in situ hybridization×400）

图5 MMP-9 mRNA在Ⅲ级胶质瘤中的表达（原位杂交法×400）Figure5 Expression of MMP-9 mRNA in gradeⅢglioma（in situ hybridization×400）

图6 MMP-9 mRNA在Ⅳ级胶质瘤中的表达（原位杂交法×400）Figure6 Expression of MMP-9 mRNA in gradeⅣglioma（in situ hybridization×400）

3 讨 论

人脑胶质瘤的生物学行为和肿瘤细胞的侵袭情况密切相关。胶质瘤浸润和转移包括3个步骤，肿瘤细胞黏附到细胞外基质，并与在基底膜表面分布的整合素受体及非整合素受体相结合；肿瘤细胞所分泌的蛋白水解酶降解、破坏由细胞间基质和基底膜组成的细胞外基质；伸出伪足的肿瘤细胞向已被蛋白水解酶降解的基质区域运动。MMPs一方面通过降解破坏基底膜和包绕肿瘤的基质，突破基质屏障，促进肿瘤侵袭转移；另一方面通过促进新生血管的形成从而参与肿瘤的生长和侵袭。

MMPs系统一类Zn2+依赖多基因内肽酶家族。MMPs主要由氨基端的信号肽和前肽部分，中间的催化活性区域和羧基末端区域构成。目前普遍认为，MMPs涉及与恶性肿瘤相关的多个过程，包括肿瘤侵袭、转移、血管生成及肿瘤细胞的增殖。胶质瘤的侵袭性与其MMPs的表达与活化有密切的关系。在检测瘤组织中MMPs水平时发现，过表达的MMP -9与脑胶质细胞瘤的病理分级、恶性进展、患者预后等因素直接相关［1］。应用Northern blotting和免疫组织化学技术对临床组织标本检测表明，胶质细胞瘤中存在MMP-9的转录和表达，并随胶质瘤恶性程度的增高，其转录和表达水平亦明显增加。胶质细胞瘤中同样观察到细胞因子和生长因子对MMPs基因的表达和蛋白分泌的调节作用。这些因子有白细胞介素-21、肿瘤坏死因子-α、转化生长因子-β、白细胞介素-1，肿瘤坏死因子-α诱导MMP-9的表达和分泌，TGFβ则以剂量依赖方式抑制白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α诱导的MMP -9转录和表达。MMP-9作用于基膜，使细胞外基质和基底膜降解，从而血管内皮细胞出芽形成新生血管，加速肿瘤细胞生长和侵袭［2］，MMP-9是血管发生启动系统中的成员，能够上调肿瘤血管化［3］，在肿瘤的侵袭转移中发挥作用。血管形成是恶性肿瘤侵袭转移的一个重要环节，研究发现［4］，高级别胶质瘤微血管密度（microvessel density，MVD）表达显著高于低级别胶质瘤（P＜0.01），MVD的表达与胶质瘤的病理分级呈正相关，MMP-9与肿瘤MVD表达强度情况相关，随着MMP-9表达增高，MVD也逐渐增加，其血管形成趋向活跃，提示了在胶质瘤血管形成中MMP-9可能具有正向调节作用。血管形成是胶质瘤侵袭和生长的必要条件之一，新形成的血管造成的裂隙为肿瘤细胞向外侵入周围正常组织开启了道路，MMP-9既可以降解细胞外基质和基底膜，使之从肿瘤邻近组织迁徙到肿瘤组织，又可以与一些血管生长调节因子协同作用最终参与肿瘤组织新生血管形成。Rooprai等［5］发现胶质瘤的瘤细胞和肿瘤的血管基底膜及内皮细胞均有MMP-9的表达，其表达随着胶质瘤病理级别的增高而增强。

本结果与上述报道结果相似，说明在脑胶质瘤中MMP-9表达增高，且与肿瘤的恶性程度呈正相关。MMP-9与肿瘤的侵袭性有密切关系，可以促进肿瘤的生长和发展。提示MMP-9可以作为判断肿瘤预后的一个重要指标。

［1］ 张军普，许雯，刘向辉.PTEN、E-cd和MMP-9在人脑胶质瘤的表达和意义［J］.山东大学学报，2010，48（2）：109-112.

［2］ 李树合，周定标，余新光，等.胶质母细胞瘤中MMPs和TMPs的表达及其与瘤周水肿的相关性分析［J］.军医进修学院学报，2006，27（3）：214-215.

［3］ SEANDEL M，NOACK-KUNNMANN K，ZHU D，et a1.Growth factor-induced a-ngiogenesis in vivo requires specifc cleavageof fibrillar type I collagen［J］.Blood，2001，97（8）：2323-2332.

［4］ 孙荣辉，徐国政.VEGF、MMP-9在人脑胶质瘤中的表达及其意义［J］.中国临床神经外科杂志，2010，15（5）：273-277.

［5］ ROOPRAIHK，RNCKLIDGE GJ，PANOU C，et al.The effects of exogenous growth factors on matrix metalloproteinase secretion by human brain tumor cell［J］.Br JCancer，2000，82（1）：52-55.

（本文编辑：刘斯静）

EXPRESSION OF MMP-9 IN HUMAN GLIOMA AND THEIR SIGNIFICANCE IN THE PATHOGENESIS

WANG Yi1，LIU Zhihong2，JIAO Baohua3，CHEN Yonghan1，ZHANG Gang1
（1.Department of Neurosurgery，Cangzhou Central Hospital，Hebei Province，Cangzhou 061000，China；2.Department of
Endocrinology，the Second Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050000，China；3.Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

ObjectiveTo explore the relationship between the matrix metalloproteinases-9（MMP-9）and the pathogenesis of brain glioma.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of MMP-9 in 52 cases of brain glioma，MMP-9 mRNA was detected in brain glioma by in situ hybridization.ResultsThe expression of MMP-9 was positively correlated with tumor classification（P＜0.01）.There was positive correlation between MMP-9 mRNA and tumor classification（P＜0.01）.ConclusionMMP-9 may be involved in the development of brain glioma. MMP-9 is a prognostic indicator in brain glioma.

matrixmetalloproteinases；glioma；immunohistochemistry

R739.4

A

1007-3205（2012）02-0147-04

2011-09-30；

2011-12-23

王毅（1980-），男，山东冠县人，河北省沧州市中心医院主治医师，医学硕士，从事神经外科疾病诊治研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.02.009