薄层等电聚焦-X-射线荧光光谱法测定铁超载小鼠肝中铁含量分布

张 燕，刘家琴，高中洪

(1.西华大学物理与化学学院,四川 成都 610039；2.华中科技大学化学与化工学院，湖北 武汉 430074)

铁是人体必需的微量元素之一，对维持人体正常机能起着十分重要的作用[1，2]。但是长期以来，人们只注意到铁营养价值的一面，而忽略了铁过量的潜在危害。铁超载(Iron overload)，或者称为铁负荷，是指由于遗传因素或病理条件下铁摄入过多，导致机体出现一系列病理变化，特别是肝、肾损伤。铁超载常见于过度输血、血红蛋白合成障碍、膳食结构改变等，特别是后者逐渐受到许多学者的重视。人可因大量食用铁强化食品或红肉(血红素铁)、超量服用维生素C或某些含铁多的药物(尤其是补药)、使用铁制炊具、长期饮酒(红酒中含铁较多)等，导致体内铁超载[3]。研究发现，过多的铁会损伤细胞，引发遗传血色病[4，5]、神经退行性疾病[6]、心血管疾病[7]及糖尿病等[8,9]。

薄层等电聚焦(Thin-layer isoelectric focusing)是一种高分辨率的蛋白质分离技术，其基本原理是利用蛋白质等电点的不同，在一个稳定的、连续的、线性的pH值梯度中进行蛋白的分离分析[10]。X-射线荧光光谱法(X-Ray fluorescence spectrometry，XRF)是常用的非破坏性元素定性和定量分析技术，分析范围广、操作便捷，可用来测量性质差别很大的样品，不受元素价态以及试样形状和大小限制，且不要求或只要求做极少量样品准备工作。如Szökefalvi-Nagy等[11,12]用电泳分离铁-硫蛋白及含Fe、Ni的氢化酶后，采用质子激光X-射线荧光法直接测定蛋白条带中Fe、Ni的含量。高愈希等[13]采用电泳和同步X-射线荧光法分析了人肝细胞胞质溶液中金属蛋白的分布。陈春英等[14,15]也采用同样的方法分析了金属硫蛋白在不同组织中的分布。

铁超载后，铁在肝中大量聚积[16]。因肝中各个亚细胞器结构和功能的不同，可以推测铁超载后各亚细胞器中铁含量的增加将有所差异。目前，关于铁超载后蛋白铁在体内主要脏器中的分布和定位方面的研究还很少报道。

作者在此采用薄层等电聚焦和X-射线荧光光谱法分析铁超载后，小鼠肝中各个亚细胞器中铁含量的分布，以进一步探究铁超载导致机体损伤的机理。

1 实验

1.1 动物分组、饲养及处理

昆明种小鼠，清洁级，体重(20.6±0.5) g左右，雄性，购自湖北省卫生防疫站。小鼠随机分为2组，每组4只，分别为阴性对照组和阳性对照组。2组均给以正常饲料，正常饮水。阳性对照组隔1 d按100 mg·(kg bw)-1腹腔注射浓度为20 mg·mL-1的右旋糖苷铁，共注射5次，右旋糖苷铁总注射量为500 mg·(kg bw)-1；而阴性对照组则注射同量的生理盐水。最后一次注射完后再喂养(室温、正常光照及饮水)45 d后，于第46 d用戊巴比妥酸麻醉后迅速取出小鼠肝脏(处理前一晚禁食，正常饮水)，在冰冷的生理盐水中洗净余血，脏器用滤纸吸干，称重。称取部分组织，剪碎，然后和冰冷的磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4，4 ℃)按1∶9的比例制成10%的组织匀浆。

1.2 肝胞液、线粒体、微粒体的制备

取10%的组织匀浆，用低温低速离心机以1000～2000 r·min-1离心10 min，弃沉淀；上清液在低温高速离心机上以8000～10 000 r·min-1离心15 min，上清液即为肝胞液；沉淀用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，反复离心后沉淀即为线粒体；取肝胞液在低温高速离心机上以105 000×g离心1 h，沉淀用磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，重复离心后沉淀即为微粒体。

1.3 薄层等电聚焦分析

115 mm×85 mm×0.5 mm的5%聚丙烯酰胺凝胶(内含5%的甘油以及2.4%的载体两性电解质，pH=3.0～9.5)。上样量20 μL，且上样靠近正极端。聚焦采用分步升压方式：100 V，30 min；200 V，60 min；280 V，60 min。用表面电极测定凝胶沿电泳方向的pH值梯度分布。在凝胶上覆盖一层玻璃纸，置洁净干燥通风处干燥。

1.4 X-射线荧光光谱分析

在中国科学院高能物理所核分析室的PW1830型X-光机上进行。阳极电压30 kV，电流强度40 mA，为钼阳极靶。为了忽略样品对入射X-射线吸收的影响，在X-光管出口处放置一定厚度的铝箔以吸收低能X-射线。干胶板固定在样品移动台上，选好位置后用1 cm×0.5 cm的光斑照射样品。发出的X-射线由垂直于入射方向Si(Li)探测器探测，信号经Ortec X-射线荧光光谱仪获取输出。沿电泳方向每隔1～2 mm取一个XRF谱。

1.5 数据处理

采用AXIL软件，并用来源于空气且含量恒定的Ar信号峰对其它信号峰进行归一化。用Mathematic软件拟合各点，得到拟合曲线，并求出拟合曲线下面积，以信号峰面积表示相应位置的金属相对含量。将同一条带内各位置铁信号峰面积对取谱位置作图，曲线下总面积即代表该条带内的铁含量。

2 结果与讨论

2.1 肝胞液中铁含量分布(图1)

a.薄层等电聚焦电泳条带中各位置点的铁含量分布 b.不同等电点所对应的铁含量分布

从图1可以看出，肝胞液中共有3处铁相对记数较高，分别位于正极端、距正极端34 mm处以及距正极端43 mm处，相应的等电点分别为3.0、4.7和5.7。铁超载后，3处的铁含量均较正常显著增加。

2.2 线粒体中铁含量分布(图2)

a.薄层等电聚焦电泳条带中各位置点的铁含量分布 b.不同等电点所对应的铁含量分布

从图2可以看出，线粒体中含铁蛋白主要分布在等电点5.7和7.0处。铁超载后，2处的铁含量均较正常显著增加，且分布的范围变宽。

2.3 微粒体中铁含量分布(图3)

a.薄层等电聚焦电泳条带中各位置点的铁含量分布 b.不同等电点所对应的铁含量分布

从图3可以看出，微粒体同肝胞液一样，也有3处铁相对记数较高，分别位于正极端、距正极端27 mm处以及距正极端37 mm处，相应的等电点分别为3.0、5.7和7.3。铁超载后，等电点5.7处的铁含量较正常显著增加，其它两处均无明显变化。

2.4 讨论

肝脏是体内非常重要的脏器之一，具有多种生理功能，在碳水化合物、脂质以及蛋白质的代谢中都起着十分重要的作用。肝脏除了具有合成血清蛋白(如白蛋白、抗体、纤维蛋白素原)、尿素、凝血素以及其它凝血因子等功能外，还是一个解毒中心，可以清除内源性或外源性的毒性物质[17]。

生物组织中微量元素的研究不仅具有生物学意义，而且在临床和病理学上也具有十分重要的作用。不同的病因导致组织中微量元素新陈代谢的改变，从而形成不同物质[17]。铁超载可导致机体损伤，尤其是肝脏损伤。因此，研究铁超载后肝脏中铁蛋白的含量及分布对于认识微量元素铁过多产生的生物学意义很有帮助。生物样品中金属蛋白分布的研究方法一般是将样品中的蛋白质分离后测定其中的金属含量[12]。但由于生物样品的复杂性，研究生物样品中金属蛋白分布要求高效、高分辨率的蛋白质分离方法以及高灵敏度的微量元素检测方法，这也是本实验采用薄层等电聚焦-X-射线荧光光谱法分析铁超载后小鼠各亚细胞器蛋白中铁含量分布的原因。本实验将薄层等电聚焦凝胶进行干燥处理后再进行X-射线荧光分析，从而大大减弱了由凝胶材料所引起的光源康普顿散射。

肝脏是含铁化合物进行代谢和贮存的主要器官。实验发现：铁超载后，肝脏中铁含量显著增加，而且无论是肝胞液、线粒体还是微粒体，铁含量均较正常组显著增加。但3个亚细胞器铁含量的增加量具有一定差异性，且存在如下关系：微粒体>肝胞液>线粒体。其原因可能是机体摄入的铁被消化道吸收后，主要在肝细胞微粒体中进行代谢而被肝细胞吸收。另外，肝胞液和微粒体正极端附近的铁相对记数较高，这说明肝胞液和微粒体中存在某些带有负电荷的含铁蛋白，但具体形式还有待进一步证实。肝胞液中另外还有2处铁相对记数较高，其等电点分别为4.7和5.7，其中4.7与转铁蛋白的等电点一致，5.7与铁蛋白的等电点一致。与肝胞液和线粒体相比较，尽管微粒体中含铁蛋白也有3处分布，但铁超载后，微粒体中含铁量增加相对集中，增加的含铁蛋白的等电点位于5.7处，这可能是因为铁的贮存及代谢都主要发生在肝微粒体中的缘故。上述现象表明，铁超载可导致肝胞液、线粒体和微粒体3个亚细胞器中铁含量显著增加，但因不同亚细胞器具有不同的生物学功能，所以3个亚细胞器的铁含量分布也具有一定差异性。

3 结论

采用薄层等电聚焦-X-射线荧光光谱法对铁超载小鼠肝中铁含量的分布进行了研究。结果表明：机体摄入过量铁，肝胞液、线粒体以及微粒体中铁含量都较正常小鼠显著增加，且增加的量存在如下关系：微粒体>肝胞液>线粒体；肝胞液中含铁蛋白主要分布在等电点3.0、4.7和5.7处，线粒体中含铁蛋白主要分布在等电点5.7和7.0处，微粒体含铁蛋白主要分布在等电点3.0、5.7和7.3处；铁超载后，肝胞液和线粒体各处铁含量均显著增加，而微粒体中所增加的铁主要集中在等电点5.7处。

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