高效液相色谱串联质谱分析黄芩水煎液的有效成分※

何秋毅宋伟峰马斌李瑞明陈 孝

高效液相色谱串联质谱分析黄芩水煎液的有效成分※

何秋毅1宋伟峰2马斌1李瑞明1陈 孝1

目的采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）联用技术，对黄芩水煎液中的有效成分进行初步分析。方法采用 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱，以乙腈和水（含体积比 0.5%甲酸）为流动相，采用梯度洗脱，流速为0.4mL/min，ESI-MS采用负离子模式。通过HPLC-MS/MS在线测定化合物的一级和二级质谱信息，结合文献报道，对黄芩水煎液的有效成分进行分析鉴别。结果结合文献报道和质谱数据，21个成分通过串联质谱进行了结构鉴定，4个通过对照品得到了确证。结论高效液相色谱串联质谱法是鉴定黄芩药材化学成分的有效方法。

黄芩；水煎液；化学成分；高液相色谱串联质谱

黄芩（Radix Scutellariae）为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根[1]。黄芩是中国药典收载品种，产于河北、辽宁、陕西、山东、内蒙古、黑龙江等地，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎，用于湿温、暑湿，胸闷呕恶，湿热痞满，泻痢，黄疸，肺热咳嗽，高热烦渴，胎动不安等[2]。现代研究证明，黄芩主要含黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、汉黄芩苷、黄芩新素、β-谷甾醇等成分[3-5]。它的抗菌谱较广，对多种细菌、皮肤真菌、钩端螺旋体等都有抑制作用；另外，还具有抗炎和抑制流感病毒、乙型肝炎病毒的作用[6-8]。

随着分析科学的不断发展，液质联用技术已广泛用于中药及生物样品的分离分析。串联质谱具有分析速度快、灵敏度高、能给出分子结构信息等优点，采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS），可以获取各化合物的一级和二级质谱信息，从而迅速对中药化学成分进行快速分析鉴别。另外，由于中药饮片主要采用水煎煮的方式服用，研究其水提取液的化学成分具有重要的意义。本文采用高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS/MS）分析黄芩水煎液中的有效成分，为黄芩的物质基础和作用机理研究奠定了基础。

图1 黄芩水提取液的总离子流图

表1 黄芩水提取液的HPLC-MS分析结果

1 仪器与试剂

Agilent1100高效液相色谱仪（配有DAD检测器、自动进样器、四元泵），6410B QqQ-MS电喷雾串联质谱仪（美国Agilent公司)，配有MassHunter数据处理系统；色谱柱：ZORBAX SB-C18高效液相色谱柱（100mm×2.1mm，3.5μm，美国 Agilent公司）。色谱流动相甲醇、乙腈为色谱纯（德国Merck公司），甲酸为分析纯（广州化学试剂厂），实验用水为 Milli-Q超纯水。黄芩药材购自广州采芝林药店，经鉴定为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。

2 方法与结果

2.1样品提取取黄芩药材适量粉碎，准确称取10g置圆底烧瓶中，加100mL水，回流提取2h，提取液冷却后转移至 100mL的容量瓶中，定容后过0.45µm滤膜，作为供试品溶液。

2.2色谱及质谱条件色谱条件：ZORBAX SBC18高效液相色谱柱（100mm×2.1mm、3.5μm）；流动相A为0.5%的甲酸溶液，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序如下：0～2min，0%B；2～5min，0%～12%B；5～25min，12%～30%B；25～35min，30%～60%B；35～45min，60%～95% B；45.1min，0%B保持10min。流速0.4mL/min；进样量：5.0μL，柱温：25℃。

质谱条件为电喷雾离子源，负离子扫描模式；喷雾气压力：40psi；干燥气（N2）流速：10.0L/min，干燥气温度：350℃；毛细管电压：4000V，碎裂电压：100V，锥孔电压：60V，碰撞能量0～20V，质量数扫描范围为50～1500m/z。

2.3成分分析图1为黄芩药材水提取液的HPLCMS分析总离子流色谱图，色谱图上有30个明显的色谱峰，通过与相关文献[9-10]比较每个色谱峰一级质谱信息、二级质谱信息以及C18色谱柱的洗脱顺序，其中的21个化合物得到了推测鉴定，这些化合物的保留时间、一级质谱、多级质谱和分子式详细信息见表1，详细色谱图信息见图1。其中10、20、23、27号色谱峰分别是黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素，这四个色谱峰通过与对照品对照比较保留时间、一级质谱和多级质谱信息得到了确证。黄芩主要含有黄酮类化合物，其中黄酮苷类包括碳苷（如白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷）和氧苷类化合物（如黄芩苷）。碳苷是一类特殊的化合物，其糖基以 C-C键直接连在苷元的碳原子上。白杨素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷(2)为碳苷，在二级质谱中，能够观察到[M-H-60]-、[M-H-90]-和[M-H-120]-的信号，与黄酮碳苷质谱裂解的特征信号一致。黄芩苷(10)、汉黄芩苷(20)等氧苷在二级质谱中则明显失去一份子的葡萄糖醛酸，得到[M-H-176]-的信号。其它 9个色谱峰由于缺乏相关的文献报道和对照品，结构有待进一步分析鉴定。

3 讨论

HPLC-MS/MS是分析黄芩有效成分的强有力工具，通过采用串联质谱分析化合物的一级和二级质谱信息，可以大致推测出化合物的结构和类型，从而在没有标准品的条件下，也能对黄芩中的有效成分进行定性。本实验通过对黄芩水煎液进行了HPLC-MS/MS分析，研究了其水溶性的化学成分，通过HPLC分离共得到了30个化合物，其中鉴定了21个化合物。黄芩主要含有黄酮类成分，本研究能快速的分析鉴定黄芩中的黄酮类成分，同时还能根据质谱的特征离子，鉴定黄芩中特殊的碳苷化合物。本方法具有快速、灵敏度高的特点，可以作为黄芩药材鉴定的有效方法。

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Identification of the Major Components From the water Extract of Radix Scutellariae by High-performance Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

He Qiuyi Song Weifeng Ma Yanbin Li Ruiming Chen Xiao

ObjectiveTo identify the active components in Radix Scutellariae by high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).MethodsThe separation was performed on an Agilent ZORBAX SB-C18 column with gradient elution of acetonitrile and water (containing 0.5% formic acid)as mobile phase,the flow rate was 0.4 mL/min.On-line ESI-MS/MS in negative mode was used to obtain the MS1 and MS2 data of the analytes.ResultsAccording to the literature and high-resolution data,21 compounds were identified by HPLC-MS/MS and 4 of them were confirmed by a comparison of their tR,MS data with those of the reference substances.ConclusionHPLC-MS/MS is demonstrated as a powerful tool for the rapid identification of the chemical constituents in Radix Scutellariae.

Radix Scutellariae; Water extract; Components; High-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

1 中山大学附属第一医院药学部，广东广州 510080

2 中山大学附属第三医院药学部，广东广州 510630

广东省重大科技专项项目（2011A080300004）；广东省中医药局科研项目（20121145）

何秋毅（1981.9-），男，本科，药师，主要研究方向为临床药学。

李瑞明（1974.7-），男，本科，主管药师，主要研究方向为医院制剂。E-mail：liruiming321@163.com.