草坪草褐斑病菌粗毒素液对寄主叶片防御酶体系的影响

孙淑琴 李荣华 杨秀荣 田涛

摘要：分别利用草坪草褐斑病菌粗毒素5倍稀释液和10倍稀释液接种盆播坪草高羊茅，1周内逐天采集处理叶片，测定叶片防御酶(PAL,POD、PPO、CAT)活性变化。结果表明，坪草高羊茅叶片经粗毒素液处理1周内，PAL,POD、PPO活性较对照均有不同程度的提高，其总体变化趋势为先升高后降低，并且高浓度毒素处理较低浓度毒素处理的酶活性高，而经毒素处理后的坪草叶片CAT酶活性较对照却呈现下降的趋势。

关键词：草坪草褐斑病菌；粗毒素；防御酶

中图分类号：S436.8文献标识号：A文章编号：1001-4942(2012)01-0087-04

由丝核菌属(Rhizoctonia spp.)病原引起的草坪草褐斑病是世界上报道最早、分布最广、危害最重的草坪草病害之一。植株受害部位常为叶片、叶鞘和茎，发病初期，染病部位呈现梭形、长条形或不规则形水渍状病斑，后病斑中心枯白，边缘变褐，最后叶片干枯萎蔫。受害草坪初期常出现大小不等的近圆形枯草斑，条件适合时，病情快速蔓延，枯草斑直径从几厘米迅速扩大到2m左右，严重影响草坪的观赏价值和实用价值。

目前，有关草坪草褐斑病的研究大多集中于病害的识别、病原鉴定及防治药剂的筛选等研究，而对于病原菌与寄主之间互作的研究相对较少。大量研究表明，丝核菌的致病因子——毒素在致病过程中起重要作用，与寄主的致病力存在显著正相关，但报道多见于水稻等大田作物，而有关草坪草的研究尚未见相关报道。为进一步明确草坪草褐斑病病原的致病机理及病原与寄主的互作关系，本研究从病原菌代谢产物——毒素出发，研究不同浓度毒素处理对寄主体内防御酶体系的影响，明确寄主应对毒素所做出的生理反应，以期为病原菌的致病机理研究提供参考，并为病害的防治提供理论依据。

1.材料与方法

1.1供试材料

供试草坪草品种：高羊茅“火凤凰”。供试菌株：褐斑病病原RH2菌株，经鉴定为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。

1.2试验方法

1.2.1粗毒素液的制备将RH2菌株在PDA平板中扩大培养1周后，用直径0.5cm打孔器在菌落边缘打孔，挑取5块菌盘接种于150ml Ps液体培养基中，25℃静置培养20d。培养液2层滤纸过滤后，收集培养滤液。

培养滤液加入等体积乙酸乙酯萃取3次，萃取液经旋转蒸发去掉乙酸乙酯，残留的棕褐色物质即为粗毒素。由于乙酸乙酯对草坪叶片有轻微的毒性(经试验)，所以粗毒素用有机溶剂甲醇溶解。

1.2.2接种方法盆播苗出苗约1个月后接种。分别将粗毒素液稀释成5倍和10倍液作为接种体，甲醇为空白对照。分别将各接种体喷雾接种于叶片上，塑料薄膜保湿24h。试验共设3个处理，每处理重复3次。分别于接种后1、2、3、4、5、6d用灭菌剪刀剪下中上部叶片收集，各处理重复3次的叶片剪碎后混匀，冷冻保藏。

1.2.3酶粗提液的制备过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、过氧化氢酶(CAT)提取：取采集叶片0.05g，放入研钵中，加入0.01g PVP，再加入0.05mol/L预冷的磷酸缓冲液(pH7.8)1.2ml，分3次加入，冰浴研磨成匀浆，将匀浆全部转入离心管中，4℃ 12000 r/min冷冻离心30min，上清液即为酶粗提取液。

苯丙氨酸解氨酶(PAL)提取：取采集叶片0.05g，放入研钵中，加入0.01g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入5mmol/L巯基乙醇硼酸缓冲液(pH8.8)1.2ml，分3次加入，冰浴研磨成匀浆，将匀浆全部转入离心管中，4℃ 12000r/min冷冻离心30min，上清液即为酶粗提取液。

1.2.4酶活性测定

(1)PAL活性测定

反应体系为：0.1mol/L、pH 8.8的硼酸缓冲液2ml，0.02mol/L的L-苯丙氨酸1ml，酶液0.6ml。将测定管放在30℃恒温水浴锅中保温45min，取出立即加入6mol/L的盐酸1.0ml终止反应，测定290nm处的吸光值。空白对照以缓冲液代替酶液，每样品重复3次，以每分钟OD₂₉₀变化0.01为一个酶活单位。

(2)POD活性测定

反应体系为：pH7.8磷酸缓冲液2.9ml，2％过氧化氢(现用现配)1.0ml，0.05mol/L愈创木酚1.0ml，酶液0.08ml，反应体系加入酶液后混匀测定OD₄₇₀，每1min读数1次，读3min内的变化值，空白对照以缓冲液代替酶液，每样品重复3次，以每分钟OD₄₇₀变化0.01为一个酶活单位。

(3)PPO活性测定

反应体系为：pH 7.8磷酸缓冲液2.0ml，0.1mol/L邻苯二酚1ml，酶液0.5ml，反应体系加入酶液后在37℃恒温水浴锅中保温1h，取出立即加入20％的三氯乙酸2.0ml终止反应，紫外分光光度计测定OD₄₂₀，空白对照以缓冲液代替酶液，每样品重复3次，以每分钟OD₄₂₀变化0.01为一个酶活单位。

(4)CAT活性测定

反应体系为：pH 7.8磷酸缓冲液4.0ml，2％过氧化氢0.16ml，酶液0.4ml，反应体系加入酶液后立即开始计时，并测定OD₂₄₀，每10s读数1次，读1min内的变化值，空白对照以缓冲液代替酶液，每样品重复3次，以每分钟OD₂₄₀变化0.01为一个酶活单位。

2.结果与分析

2.1PAL活性变化

如图1所示(酶活值为3次重复的平均值，以下均同)，接种毒素1d后，PAL活性显著升高，5倍、10倍稀释液处理较对照分别增加33.3％和36.7％。3d后又下降至最低水平。后又迅速升高，5d后达到最高峰。整体水平来看，接种不同浓度毒素处理的PAL活性变化趋势基本一致，其中5倍稀释液处理PAL活性高于10倍稀释液，且都明显高于对照。

2.2POD活性变化

如图2所示，5倍稀释毒素液接种后，POD活性显著高于对照，出现先升高后降低2个高峰。而接种10倍稀释毒素液处理的POD活性整体呈现下降的趋势，但5d后又急剧上升。对照处理POD活性在1周内变化不大，呈现相对稳定的趋势。

2.3PPO活性变化

由图3可知，接种处理1d后，5倍、10倍稀释液处理PPO活性均明显高于对照，分别高出22.1％和59.2％。1d后，5倍稀释液处理PPO活性出现先升高后降低的趋势，共出现2个高峰。而10倍稀释液处理的PPO活性急剧下降，3d后降低到最低水平，后又急剧升高，5d时达到最高峰。从整体水平看，接种毒素处理后，寄主PPO活性明显升高。

2.4CAT活性变化

由图4可知，毒素处理后，CAT活性较对照明

显下降。毒素处理后1～4d，10倍稀释液毒素处理CAT活性从最低值一直处于缓慢上升阶段，4d后迅速升高。而5倍稀释液毒素处理的叶片内CAT活性是迅速升高而后又迅速降低，4d时为最低，后又迅速上升。2个处理问相比较，5倍稀释液处理CAT活性较10倍稀释液处理较高，4d后都处于平稳上升阶段。而对照处理CAT活性明显高于毒素处理，3d后处于平稳下降趋势。

3.讨论与结论

在正常状态下，由于植物体内防御酶(如SOD、POD、CAT等)等活性氧清除系统的存在，使活性氧代谢处于低水平动态平衡之中。但如果植物遭受到外界不良因素的影响后，植物体内的防御酶活性会发生相应的变化，以增强植株的抗逆性，最大限度地适应不良环境。

众多试验表明，接种病原菌的致病因子后，寄主做出的生理反应和接种病原菌后寄主的生理反应是相似或相同的，这也进一步揭示了病原菌的致病机理。

本研究表明，草坪草叶片接种病原菌粗毒素液后，寄主叶片内POD、PPO、PAL活性较对照都有不同程度的提高，并且高浓度毒素处理较低浓度毒素处理酶活性维持较高水平，说明粗毒素液作用寄主后，寄主启动防御酶系统抵制不良侵害，并且侵害程度越大，防御酶活性提高得越多。这进一步证实了草坪草褐斑病菌的致病因子可能为毒素。徐艳(2006)利用水稻纹枯病菌粗毒素(稀释20～100倍)处理水稻叶片和叶鞘后，POD、PPO、PAL、SOD活性较对照都有不同程度的升高，并且随着毒素处理时间的延长，这些酶活性不断增强。其结论与本试验结论一致，原因可能为：水稻和禾本科草坪草同属于禾本科作物，寄主内的防御酶系统可能相同或相近，所以同种病原菌因子处理后，寄主体内防御酶系统应答反应相近。本试验毒素处理后，CAT活性较对照有明显下降的趋势，分析其原因可能是由于毒素处理后，叶片内活性氧迅速增加，为了消除过量活性氧带来的伤害，在一定程度上消耗了一定的酶活，使其活性降低。

总之，褐斑病菌粗毒素液处理坪草叶片后，叶片防御酶活性发生了一系列变化，这在一定程度上反映了病原菌毒素侵染寄主后，寄主在生理上做出的应答反应，揭示了病原菌毒素在致病过程中的作用，为病原菌和寄主互作及病原菌致病机理研究提供了理论依据。在寄主一病原物互作中，由于植物、病原菌的遗传背景各不相同，各种酶的特性也不尽相同，因此在研究不同的植物与不同的病原菌互作中，寄主防御酶系统也可能会发生不同的变化。

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