普通小麦镉吸收基因Cdu1组成的功能标记检测

张乐 陈为序 董慧 陈桂玲 余利 李兴锋

摘要：利用新开发的功能型共显性分子标记usw47对86份供试普通小麦品种(系)的镉吸收基因Cdu1组成进行了检测和分析，结果表明：59个材料具有低镉吸收型对应的375bp特异带，占68.60％；27个材料具有高镉吸收型对应的225bp特异带，占31.40％。在47份小偃6号的衍生材料中，有74.47％的衍生品种(系)在镉吸收基因Cdu1基因位点上与小偃6号一致，具有低镉吸收型的优良等位变异；25.53％的衍生后代具有高镉吸收型的等位变异类型。山东省近年选育的小麦材料中多数具有低镉吸收型的特异条带。

关键词：小麦；镉吸收基因；Cdu1；功能型分子标记

中图分类号：Q754文献标识号：A文章编号：1001-4942(2012)01-0006-05

镉(Cd)是一种有毒金属，以微量形式自然存在于几乎所有的土壤中，被认为是最重要的重金属环境污染物之一。农业、采矿业以及工业生产活动使大量的镉进入环境中，并随着污泥农用及污灌等进入农田生态系统，造成土壤镉污染日趋严重。当镉在土壤环境中含量达到或超过伤害阈值时，就会抑制作物根系生长，降低其光合作用和叶绿素含量，破坏作物体内保护酶系统，干扰碳、氮代谢及水分和养分吸收，使质膜透性加大等，表现出明显的中毒症状，如植株矮小、叶片褪绿、生长迟缓等，严重影响作物产量。更为严重的是，镉能够在作物体内，特别是籽粒中大量积累，并通过食物链传递和富集，从而危害人体健康，日本的骨痛病就是镉污染大米所致。含镉食物，尤其含镉谷物和蔬菜是人体内镉的主要来源。因此，如何降低镉在农作物中的富集受到广泛关注。目前，联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)的食品法规委员会已设定了小麦中镉含量的标准值，为0.2mg/kg(CODEX STAN193-1995，2009)。

部分硬质小麦品种具有富集镉元素使谷物中镉水平超过上述标准值的基因潜力，该性状由主效基因控制，该基因被定名为Cdu1，并被定位于5B染色体的长臂上。了解小麦品种Cd吸收的遗传基础及其基因组成，可以为选育低镉吸收型品种提供理论依据。分子标记辅助选择在育种中的应用越来越受到重视。ScOpc20是一个SCAR标记，已经被成功用于培育低镉吸收型的小麦新品种，但由于它是一个与高镉含量相关的显性标记，因此限制了该标记在回交育种中的应用。Wiebe等(2010)开发了一个与作物镉吸收性状基因变异共分离的EST衍生标记(XBF474090)，该标记已经被成功转化为一个共显性CAPS标记，并被定名为usw47。在用限制性内切酶Hpyl88 I对PCR扩增产物进行消化之后，经电泳分析，该标记可用于检测镉吸收性状基因的两个等位基因，并成功将96个小麦品系分成低镉吸收型或高镉吸收型。因此，usw47在低镉吸收型小麦新品种的选育中具有广阔的应用前景。

本试验利用镉吸收基因Cdu1的功能型分子标记usw47对86份小麦材料进行检测，旨在明确这些材料中镉吸收等位基因的基因组成，同时分析探讨了其中的小偃6号及其衍生系的镉吸收基因的等位变异，以期为培育低镉小麦品种奠定一定的理论基础。

1.材料与方法

1.1试验材料

所用材料共86份，见表1。其中1～52号包括小偃6号、其亲本小偃96和郑引4号、两个姊妹系品种小偃4号和小偃5号及小偃6号的衍生材料，由中国科学院遗传与发育生物学研究所李振声课题组提供；中国春、J-11、IKE、Wx1D、江苏白火麦、Chancellor、铭贤169为遗传材料；60～86号材料为山东省近年育成品种，由山东农业大学农学院提供。所有材料在2009～2010年国家小麦改良分中心泰安试验基地统一种植，田间常规管理。

1.2DNA的提取

每个品种选取幼嫩叶片5～6cm，经液氮冷冻后研磨成粉末，放入2ml离心管中，采用SDS一酚法提取小麦基因组DNA，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，用于镉吸收基因Cdu1位点的分子检测。

1.3特异性标记

镉吸收基因相关标记usw47序列参考网站http：//maswheat.ucdavis.edu/protocols/Cadmium/index.htm，所用特异性引物由上海生工公司合成，分别为usw47-F：5'-GCTAGGACTTGAT-TCATTGAT-3'，usw47-R：5'-AGTGATCTA-AACGTTCTTATA-3'。

1.4PCR扩增及酶消化

PCR反应体系均为20μl，含10×PCR buffer2.5μl，2mmol/L MgCl₂2μl，200mmol/L dNTPs1.5μl，每个引物1μl(约10ng)，基因组DNA 3μl(30～100ng)，TaqDNA聚合酶1U，其余由ddH₂0补齐。PCR扩增程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸60s，35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR扩增产物首先经Hpy 188I限制性内切酶消化，酶消化反应体系均为15μl，含PCR产物4μl，NEB Hpyl88I 0.25μl，NEB buffer4 1.5μl，ddH₂0 9.25μl。酶消化程序为：37℃反应1h；65℃酶变性20min；最后维持在10％。

消化产物采用6％～8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测，1×TE缓冲溶液，凝胶经硝酸银染色，显影后采用天能GIS凝胶图像处理系统扫描成像。

2.结果与分析

usw47为共显性标记，PCR产物经限制性内切酶Hpy l88 I消化后，电泳结果显示出两条差异带，大小分别为375bp和225bp，分别对应低镉吸收型等位基因和高镉吸收型等位基因。此标记清晰易读，重复性好，可用于检测镉吸收基因Cdu1位点上等位基因相应的类型。

本试验所用86份小麦材料中，59份材料扩增出375bp的特异性条带，为低镉吸收型，占68.60％；27份材料扩增出225bp的特异性条带，为高镉吸收型，占31.40％(表1)。

小偃6号及其亲本小偃96和郑引4号、姊妹系小偃4号和小偃5号均扩增出375bp的特异性条带，均为低镉吸收型。47份小偃6号的衍生材料中，有35份材料扩增出375bp的特异性条带，占74.47％；有12份扩增出225bp的特异性条带，分别是白春5号、晋麦41、晋麦60、鲁麦14、陕213、陕253、西农2258、小偃15、郑麦9023、郑麦9405、郑农16、郑优7号，占25，53％(表1)。部分小偃6号衍生材料的多态性检测结果见图1。

遗传材料中国春、Chancellor、J-11、IKE、江苏白火麦和铭贤169及山东省重要的小麦品种如

济麦19、济南17、山农15、临麦2号、临麦4号、潍麦8号、烟农19等扩增出225bp的特异带，为高镉吸收材料；而济麦20、济麦21、济麦22和多数山农系列品种为低镉吸收类型(表1)。部分遗传材料及山东省育成品种的多态性检测结果见图2。

3.讨论与结论

镉是一种重要的环境和工业毒物，也是一种半衰期很长(长达10～35年)的多器官、多系统毒物，随着人类生活生产活动，逐渐在土壤中及作物体内积累，不仅对农作物的生长发育、光合特性、产量、品质等理化性状产生影响，而且可经食物链进入人体，严重影响人类健康。植物硫代谢、抗氧化系统和Cd²⁺跨膜运输是植物对重金属镉响应的主要途径。但，李妍发现，抗氧化酶未对镉胁迫条件下的小麦幼苗起到明显的保护作用。因此，分析作物的镉耐受差异、缓解镉对农作物的毒害、培育低镉吸收型作物品种成为研究的焦点。小麦是我国北方地区的主要粮食作物之一，了解现有小麦品种镉吸收的遗传基础及其基因组成，对培育低镉吸收型小麦品种意义重大。

本研究利用镉吸收基因的功能型分子标记usw47对86份小麦品种(系)进行分子检测，结果表明，大多数材料(68.60％)具有低镉吸收型所对应的等位变异。其中，小偃6号及其亲本小偃96和郑引4号、姊妹系小偃4号和小偃5号、35个衍生材料均为低镉吸收型，说明骨干亲本小偃6号具有低镉吸收型的优良基因潜力，而其大多数衍生材料能很好地保存低镉吸收型的优良基因等位变异。遗传材料除WxlD为低镉吸收类型外，中国春、J-11、IKE、江苏白火麦、Chancellor和铭贤169均为高镉吸收型，不宜用于低镉吸收型小麦新品种的选育。

在27个山东省育成的小麦品种中，18个为低镉吸收型，占66.67％；9个为高镉吸收型，占33.33％。一些育成年限稍长的品种，如鲁麦14、济南17，多为高镉吸收型；而大多数新育成的品种，如良星99、山农14、山农16、烟农23、烟农24、烟农25、济麦20和济麦21等，均为低镉吸收型品种，说明这部分品种可以用作选育低镉小麦的亲本。值得注意的是山农14和山农15虽都是济南17(高镉吸收型)的后代，但一个为低镉吸收型，一个为高镉吸收型，这可能是由杂交组合的另一个亲本不同造成的。

本研究仅是利用功能标记usw47对普通小麦的镉吸收基因类型进行初步鉴定，对于鉴定出的低镉吸收型小麦品种，还需通过土培和水培相结合的方法进一步验证。随着小麦基因组学研究的进展和研究技术的提高，将会有更多的功能标记被开发出来并用于准确检测相关基因位点的等位变异。

参考文献：

[1]顾继光，林秋奇，胡韧，等.土壤一植物系统中重金属污染的治理途径及其研究展望[J].土壤通报，2005，36(1)：128-133.

[2]赵其国，周炳中，杨浩，等.江苏省环境质量与农业安全问题研究[J].土壤，2002，34(1)：1-8.

[3]Das P，samantaray S，Rout G R Studies on cadmium toxicityin pjans：a review[J].Environmental Pollution，1997，98：29-36.

[4]何俊瑜，任艳芳，朱诚，等.镉胁迫对镉敏感水稻突变体活性氧代谢及抗氧化酶活性的影响[J].生态环境，2008，17(3)：1004-1008.