细胞蛋白依赖性激酶10与病理性瘢痕

杨琳

1970年，Paul Nurse等以裂殖酵母为实验材料，发现了许多细胞周期调控基因，如：裂殖酵母cdc2等。CDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，称为细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK），因此CDC2又被称为CDK1，激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将H1磷酸化导致染色体的凝缩等，这些效应的最终结果是细胞周期的不断运行。因此，CDK激酶和其调节因子又被称作细胞周期引擎。目前发现的CDK在动物中有13种，各种CDK分子均含有一段相似的激酶结构域，这一区域有一段保守序列，即PSTAIRE，并根据这一保守域的序列而命名，其与细胞周期蛋白的结合有关[1]。1994年，Grana和Brambilla 等[2-3]分别用两种不同的PCR方法发现了CDK10，但到目前还没有发现一种细胞周期蛋白与其结合。随后，Li等[4]做了显负性突变体（Dominant negative mutant）和抗敏菌的实验，结果表明CDK10在细胞周期的G2/M期起到重要作用。人类CDK10的三种基因形式（hcdk10-1：X78342， hcdk10-2： L33264， hcdk10-3：AF153430）在2000年才被正式确定[5]。hcdk10-1与转录因子Ets2结合并调节其转录活性[6]，hcdk10-2与细胞周期G2-M期有关[7]，目前为止，hcdk10-3的功能尚认识不足。

1 细胞蛋白依赖性激酶10（CDK10）的分子结构

现发现CDC2激酶广泛存在于从酵母到人的多种生物中，形成了一个庞大的家族。不同生物种族，其结构虽有差异，但具有很高的同源性[4]。典型的CDK 包含300 个氨基酸构成的催化亚基，处于磷酸化状态时其激酶活性能够被激活[8]。目前已发现CDKs家族有13个成员，均属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，其DNA序列同源性超过40%，其蛋白产物相对分子质量为30～40Ku，有一个催化核心，其磷酸化及去磷酸化决定了细胞周期的运行。Cdk10在基因图谱上位于16q249。蛋白质功能由其相应的三维结构决定10，如果缺少了三维结构，那么对研究蛋白质的功能、代谢等都带来很大的阻碍。2005年，人们发现CDK10 的三维结构中有10个α螺旋和8个β折叠。此外，CDK10的三维结构具有激酶家族的典型结构特征：N端包含β折叠区域与C端的更大α螺旋区域形成一个二裂片基序。CDK10的N端还包括了PISSLRE螺旋，这段序列对应于CDK2中的PSTALRE螺旋。发现CDK10构象中变化最多的是T-loop区。T-loop区是CDK家族蛋白里变化最多的区域，这个区域可能是寻找药物设计的一个适合区域。在于底物ATP的对接研究中发现Asp94，Lys39，Tyr21，Thr20这四个氨基酸残基是CDK10活性位点中比较重要的残基[11]。

2CDK10的活性调节

在M期，CDC25活性下降可使CDK10去磷酸化，去除了CDK10活化的障碍。而激活的M-CDK10还可以抑制它的抑制因子Wee1蛋白的活性，形成一个反馈环。因此，不难想象只要有少量的CDK25被激活，立即就会有大量的CDK10被活化。另外，CDK10的激活还需要Thr161的磷酸化，它必须在CDK激酶的作用下完成的[9]。CDK10沉默增加Ets2与c-RAF启动子结合位点的结合，使c-RAF活性增强，进而激活使其下游MAPK途径，包括MEK1，2和p42/p44 MAPK，而这又促进了cyclin D1的表达[12]。

3CDK10与细胞周期

细胞周期也称细胞分裂周期，是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个所经历的全过程，包括5个时相：G0期、G1期、S期、G2期和M期。无论是正常细胞还是肿瘤细胞的增殖都要经过这5个阶段。调控细胞周期中的许多生化事件是按一定顺序，有条不紊地进行着。细胞周期依赖性激酶家族是一组功能各异、相互联系、相互制约的核蛋白，控制细胞的增生反应，近年来已被广泛的研究[13-14]，细胞周期的进程被细胞周期依赖性激酶严格控制[15]。Hartwell还通过研究酵母菌细胞对放射线的感受性，提出了checkpoint（细胞周期检验点）的概念，意指当DNA受到损伤时，细胞周期会停下来。Cdk10的反义和显性负性突变体结构都阻止细胞周期G2～M的进程，表明cdk10参与细胞增殖的必要性[7]。

4CDK10与 Ets2 转录因子

转录因子Ets2 是ETS 家族中的一员，在细胞增殖、分化和发展中是基因表达的重要调节因子[16]。Est2转录因子包含保守点结构域（conserved pointed domain）和转录激活结构域（transactivation domain），Kasten和Giordano的研究结果则揭示CDK10和转录因子Est2的N端相互作用，抑制转录因子 Ets2 的转录活性[6]。

5CDK10与肿瘤

Charles等[17]认为 CDKs 是肿瘤细胞周期调控因子。CDK10已经被证实是非小细胞肺癌内19个新基因中的一个[18-19]，Cdk10与肝癌、胆管癌、前列腺癌、乳腺癌也有关[20]。在用三苯氧胺辅助治疗的乳腺癌患者中，CDK10低表达的患者复发的时间短并且整体存活率较差[14]。Lorn等[21-22]发现 CDK10 表达缺失可促进三苯氧胺耐药。在 RAF1 基因作用下，CDK10的表达缺失可增加转录因子ETS2 的活性，提 高 ERK /MAPK激酶通路活性并可减缓三苯氧胺耐药的产生。此外，CDK10在主动脉-冠状动脉旁路移植的疾病及滤泡性淋巴瘤中表达上调[23-24]。

6CDK10与病理性瘢痕的关系

病理性瘢痕（pathological scar）是人类真皮内特有的纤维代谢性疾病，以过量的纤维化和胶原蛋白的沉积为特征，是伤口愈合后局部纤维组织增生所致的病理状态[25]，与创伤愈合过程中胶原、 纤维连接蛋白等细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积有关，是创伤过度愈合的结果[26]，而过度沉积的ECM主要是由其中的成纤维细胞合成或分泌。透射电镜发现瘢痕疙瘩中成纤维细胞的密度和活性均增高，可见成纤维细胞是创面愈合瘢痕形成、增生和挛缩的功能性细胞，其增殖、活化分化的异常直接导致病理性瘢痕的形成[27]。刘永波等[28]的实验表明，p53基因突变可以使细胞处于增殖状态，从而导致瘢痕疙瘩的形成。TGF-β目前被认为是与瘢痕过度形成关系最密切的细胞因子，而阻断TGF-β信号通路[29-30]，有望成为防治瘢痕疙瘩的途径[31]。研究表明Ets2调节Cdc2的表达并对细胞周期有调控作用[32]。而Cdc2在哺乳细胞G2-M期起至关重要的作用，由于CDK10和转录因子Est2的N端相结合，因此，在病理性瘢痕中，其可能机制是CDK10低表达增加Ets2的转录活性，使Cdc2的水平升高，促进细胞周期进程，增加成纤维细胞数量，促进瘢痕的形成。Bowers[33]研究表明，瘢痕疙瘩的形成与内分泌的改变有一定关系。瘢痕患者在妊娠期瘢痕疙瘩出现明显的症状加重和体积增大，绝经期后瘢痕疙瘩逐渐消退萎缩。通过测定发现瘢痕组织中雄激素水平升高， 他认为，局部高水平的雄激素代谢，在瘢痕疙瘩形成中起着主要的或至少是辅助性的作用。刘嘉锋等[34]对瘢痕以及正常皮肤组织中cyclinD1 、雄激素受体的表达进行了研究，发现瘢痕组织成纤维细胞中cyclin D1 和雄激素受体表达降低，且cyclin D1 和雄激素的表达显示出一定相关性，表明雄激素受体与瘢痕的发生有关，其可能机制是通过与其配体结合，进一步启动 cyclinD1基因表达而发挥作用。前面讲到CDK10沉默最终可增强 cyclinD1的表达，因此，CDK10低表达可促进成纤维细胞的过度增生，从而促进瘢痕形成。

临床中，人们观察到瘢痕组织的形成和机体免疫应答过程非常相似，初次创伤后瘢痕组织体积较小，发生慢，类似于初次免疫应答的潜伏期，但再次受到损伤后会使瘢痕组织形成速度加快，体积增大，形成瘢痕疙瘩，类似于第二次免疫刺激的再次免疫应答过程。此外，通过对瘢痕组织中细胞和蛋白质成分分析表明，瘢痕组织中出现数量可观的特异性免疫细胞（如 T 淋巴细胞） 抗原呈递细胞（如树突状细胞和巨噬细胞），而且瘢痕组织的严重程度与创伤部位的淋巴细胞浸润有关[35]。吴勇等[36]体外培养病理性瘢痕成纤维细胞，同时，在培养细胞中加入白细胞介素-2，采用流式细胞术观察其对成纤维细胞增殖的影响，结果表明，IL-2 促进成纤维细胞增殖效应，对成纤维细胞的生长增殖起正性调节作用。研究发现在瘢痕组织中，TGF-β基因表达水平上调[37-38]。CDK10是否与这些因素有联系，有待今后进一步研究。

7小结

多数病理性瘢痕都有细胞周期调控机制的破坏导致细胞生长失控、凋亡异常的特征。CDK10作为CDKs家族新的成员，处于细胞周期调控的中心环节，在细胞生长和分化的调控中发挥重要作用。而目前对CDK10的生物学功能和调节细胞周期的机制认识尚不足。CDK10调控机制研究可能为病理性瘢痕发生、发展的研究提供新的线索，也可能为其治疗提供新的思路。

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[收稿日期]2012-05-15 [修回日期]2012-07-20

编辑/李阳利