平阳霉素诱导人血管瘤内皮细胞凋亡过程中PARP—1和Cyt—C的表达及意义

葛平等

[摘要]目的：探讨平阳霉素诱导人血管瘤内皮细胞凋亡过程中PARP-1、Cyt-C的表达及可能机制。方法：在体外培养人血管瘤内皮细胞，设立两组：A组为平阳霉素组，其中加入平阳霉素（200μg/ml），诱导血管瘤内皮细胞凋亡，B组为空白对照组。对两组血管瘤内皮细胞通过倒置显微镜、电镜观察其形态学变化，采用流式细胞仪检测平阳霉素诱导血管瘤内皮细胞的凋亡率。利用基因芯片技术筛选出差异表达的基因，从中选定PARP-1及Cyt-C表达基因，对其进行RT-PCR验证。结果：平阳霉素（200μg/ml）可以诱导体外培养的人血管瘤内皮细胞凋亡，加药24h后，在倒置显微镜和电镜下观察到明显的细胞凋亡的形态学改变，流式细胞仪检测凋亡率可达13.11%。空白对照组血管瘤内皮细胞倒置显微镜下观察无明显形态学变化，流式细胞仪检测凋亡率为3.56%。利用基因芯片技术筛选出两组差异基因4752个，其中2543个上调，2209个下调。应用DAVID软件对鉴定出来的差异基因进行生物信息学分析，从中选出与线粒体凋亡途径直接相关的蛋白表达基因：PARP-1、Cyt-C。对其进行RT-PCR检测得到的CT值显示：平阳霉素药物组相对于空白组PARP-1及Cyt-C蛋白基因呈高表达状态。结论：平阳霉素在体外可以通过多种途径诱导血管瘤内皮细胞发生凋亡，其中PARP-1及Cyt-C参与了线粒体途径调控的凋亡。

[关键词]血管瘤内皮细胞；凋亡；平阳霉素；PARP-1；Cyt-C

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）10-0-0

婴幼儿血管瘤发病率为1%～2%，尤其发生于颌面部的约占全身的60%。血管瘤一般出现在出生时或出生后10～14天，大约有40%新生儿在出生时即发现血管瘤，有两个生长高峰期，第一个高峰期为4～5月时，此期瘤体迅速增长，另一个生长高峰期为1岁左右，此期血管瘤大小达到最高峰，1～2岁时开始消退。虽然婴幼儿血管瘤的生物学行为是可自行消退的，但血管瘤的消退周期较长（10～12年）、大面积血管瘤消退后会引起局部后遗症（影响功能和美观），且特殊部位的血管瘤可能引起严重并发症、甚至威胁生命，这些都需要积极干预治疗。

血管瘤的常规治疗方法主要有口服或局部注射糖皮质激素、X线放疗、放射性同位素注射或贴敷、抗肿瘤药物局部注射、口服γ-干扰素、激光治疗等。目前，临床上治疗血管瘤最广泛的是局部注射平阳霉素硬化治疗。但其诱导凋亡机制仍不明确。

近年来越来越多的实验研究证明，婴幼儿血管瘤其消退是内皮细胞凋亡（apoptosis）所致。多个学者研究发现增生期血管瘤组织中其细胞凋亡处于较低水平，是消退期细胞凋亡水平的5倍，并且内皮细胞占这些凋亡细胞的30%[1]。经典的细胞凋亡途径有两条，第一条是细胞外途径（细胞表面死亡受体通路），另一条是细胞内途径（线粒体通路）。细胞外途径主要涉及Fas/FasL及Caspases，而细胞内途径主要与Bcl-2、Caspase9、Cyt-C（细胞色素C，cytochrome C）和Bax等相关。本研究旨从线粒体途径阐述平阳霉素诱导血管瘤内皮细胞凋亡作用机制。通过体外培养的人血管瘤内皮细胞加入平阳霉素诱导其凋亡，寻找参与线粒体代谢异常及凋亡相关的蛋白表达基因，并对寻找出的蛋白表达基因进行验证。从基因及亚细胞蛋白组学层面上对平阳霉素诱导血管瘤内皮细胞凋亡的分子机制进行深一步研究。为其理论研究提供新的实验依据，为血管瘤的临床治疗提供新的思路及方法。

1材料和方法

1.1 材料：体外培养的人增殖期血管瘤内皮细胞由西安交通大学第二医院小儿外科惠赠。传代培养至第5～6代。主要仪器及试剂：BB16紫外清洁型培养箱（Heraeus美国）、DMLED型倒置显微镜（LEICA德国）、流式细胞仪（FACSCalibur美国）、RPMI-1640培养粉（含L-谷胺酰胺）（GIBCO公司）、标准胎牛血清（TMD天津）、氨苄青霉素（美国Sigma公司）、硫酸链霉素（美国Sigma公司）、胰蛋白酶（GIBCO公司）、Annexin V-FITC PI双染细胞凋亡检测试剂盒（上海美吉生物医药科技有限公司）。

1.2方法

1.2.1 倒置显微镜观察细胞形态：分为未加药物的空白对照组和加入平阳霉素（200μg/ml）药物组（平阳霉素为商品化药物）。将两组细胞放入37℃，5%CO2的培养箱中继续培养，每小时观察细胞形态一次。待药物作用于细胞24h后分别收集两组细胞。

1.2.2 电镜观察药物作用血管瘤内皮细胞凋亡：将收集到的两组细胞分别制作切片，瑞典LKB-V型超薄切片机进行超薄切片50～70nm，醋酸铀、柠檬酸铅染色后，日本日立H-600透射电子显微镜下观察、拍照。

1.2.3 流式细胞仪检测凋亡率：离心收集细胞，用4℃预冷的PBS洗涤，1000rpm，10min；用250μl结合缓冲液重悬细胞，并使其浓度为1×106低温500～1000r/min离心5min弃去染液；加入1.0ml PI染液，4℃避光染色15min； 400目的筛网过滤1次；上流式细胞仪检测，并用随机软件分析。

1.2.4 基因芯片技术筛选差异基因：选用基因芯片为Agilent表达谱芯片（由陕西北美基因有限公司提供），按芯片操作要求检测。

1.2.5 生物信息学分析与RT-PCR验证：应用DAVID软件对鉴定出来的差异基因进行生物信息学分析，从中选出与线粒体凋亡途径直接相关的蛋白表达基因：PARP-1、Cyt-C。RT-PCR检测差异基因。

2结果

2.1不同时间点药物作用细胞反应：如图1所示：（a）2h内，细胞均呈现典型的“铺路石”状排列，细胞伪足伸展充分，贴壁良好，界线清晰，细胞核清晰可辩；（b）8h，细胞间界线开始变得模糊，个别细胞伪足开始收缩变性，间隙有所增大；（c）24h，大部分细胞皱缩变圆，细胞间间隙明显增大，细胞形态完整，部分细胞脱壁游离飘浮。

2.2 电镜观察结果：如图2所示，a空白对照组：正常血管瘤内皮细胞，可见胞浆均一，细胞表面微绒毛存在，可见相对正常的线粒体及内质网结构，包膜完整。b、c平阳霉素组：肿瘤细胞电子密度增加，细胞表面微绒毛样突起消失，细胞膜形态仍然完整，细胞核形态不规则，核内染色质凝聚形成高密度团块，边集，呈现典型的细胞凋亡变化。细胞内可见有凋亡小体形成。

2.3 流式细胞仪检测结果：见图3。

2.4 基因芯片结果：利用基因芯片技术筛选出两组差异基因4752个，其中2543个上调，2209个下调。应用DAVID软件对鉴定出来的差异基因进行生物信息学分析，从中选出与线粒体凋亡途径直接相关的蛋白表达基因：PARP-1、Cyt-C。

2.5 RT-PCR验证结果：RNA提取过程中可能发生各种途径的降解，28S/18S即为衡量提取的RNA完整性的指标，经凝胶电泳鉴定质量，图4示28S/18S为1.8～2.0；表明所提取RNA完整性较好，基本无降解发生，证明其完整性。

3讨论

目前认为细胞凋亡的途径主要有两条，一条是通过胞外信号激活细胞内的凋亡蛋白酶caspase；另一条是通过线粒体释放凋亡蛋白酶激活因子来激活caspase。这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解，引起细胞凋亡。

3.1 线粒体除了为细胞提供基本生命活动的能量以外，它还负责着感受细胞内外的刺激及氧化压力（oxidative stress）的大小，它在细胞内作为一个感应者（senser）[2-4]，根据外界刺激压力的大小来决定细胞是否发生凋亡。当外界微小的刺激或氧化压力作用于细胞的时候，线粒体会发生增生性变化，产生更多的能量（如三磷酸腺苷adenosine triphospate：ATP）来提供给细胞，以此来应对外界刺激及氧化压力带来的伤害，从而使细胞保持其固有生理功能的稳定，继续存活。当氧化压力及外界刺激超过细胞内线粒体自我修复所能承受的极限时，线粒体的形态及结构就会发生改变，这种改变会使得Cyt-C及AIF（凋亡诱导因子，apoptosis-inducing factor）释放并进入胞浆，这些细胞因子启动caspase级联反应，使细胞发生凋亡，以此方式清除体内那些衰老的、病态的、不健康的甚至发生突变的肿瘤细胞。以下三种机制是线粒体调控细胞凋亡的主要途径[5-8]，包括：①电子传递、氧化磷酸化及ATP产生的破坏；②释放细胞色素C来激发caspase级联反应；③改变细胞氧化还原位能。当外界各种不同的环境刺激（如紫外线、γ射线、内质网压力、生长因子缺失、氧化压力）作用于细胞时，过量的活性氧族（reactive oxygen species：ROS）会在细胞内产生，这些活性氧族可诱导凋亡因子Bcl-2家族蛋白（如Bax和Bak）启动，并在线粒体外膜上发生聚合，导致线粒体功能障碍，从而引发内源性途径使细胞凋亡[9]。

3.2 平阳霉素（Pingyangmycin，PYM）是一种细胞毒性糖肽抗肿瘤抗生素。临床研究证明，平阳霉素是一种疗效好、毒性小的抗肿瘤抗生素。20余年来平阳霉素亦用于治疗血管瘤，取得良好的效果，已成为血管瘤常规的治疗方法之一[10-13]。平阳霉素治疗血管瘤的可能机制有：①使组织纤维化的副作用，研究表明平阳霉素是一种血管形成抑制剂，可通过抑制血管形成而达到其治疗作用；平阳霉素可以引起血管内膜管壁结构的病理改变及造成血管内皮细胞变性，促使血栓形成，并使瘤体纤维化，从而抑制血管瘤发展，使瘤体消退；②平阳霉素直接引起DNA单链断裂，抑制细胞的代谢，干扰细胞的分裂增殖[14]；越来越多的研究证明平阳霉素可以有效的诱导血管瘤内皮细胞发生凋亡。本实验结果显示平阳霉素可以有效的诱导血管瘤内皮细胞凋亡，在倒置显微镜和电镜下观察到明显的细胞凋亡的形态学改变，流式细胞仪检测凋亡率可达13.11%。

本实验利用基因芯片，应用DAVID软件对鉴定出来的差异基因进行生物信息学分析，从中选出与线粒体凋亡途径直接相关的蛋白表达基因：PARP-1[聚腺苷酸二磷酸核糖转移酶，poly（ADP-ribose） polymerase-1]、Cyt-C，并对其进行RT-PCR验证。结果说明平阳霉素诱导血管瘤内皮细胞凋亡与PARP-1、Cyt-C介导的线粒体途径密切相关，目前尚无相关研究报道。

3.3 PARP-1在细胞凋亡中扮演的角色：PARP-1是一种广泛存在于真核细胞中，并在细胞生命循环中有重要作用的核因子，该蛋白家族的其它成员包括PARP-2、PARP-3、V-PARP和tankyrases。它的功能是探测DNA损伤，通过特异识别和绑定DNA损伤，使自身激活，对DNA修复和维持基因的稳定性有重要作用。

在经典的细胞凋亡途径中， PARP-1被caspase3和caspase7切割为p89和p21两个片段， 抑制其DNA修复功能， 使细胞内ATP不至于被PARP-1耗竭， 从而保证凋亡过程中的能量供应。然而PARP-1并不仅仅作为死亡底物被动地参与细胞凋亡，PARP-1过度激活能通过引起线粒体损伤， 诱发非caspase依赖的细胞凋亡。有研究认为除细胞核外， 还有一部分PARP-1定位于线粒体， 在过度激活时直接引起线粒体损伤和促凋亡蛋白的释放。另一种可能是， PARP-1 通过其它信号分子引起线粒体功能受损。

本次实验发现平阳霉素诱导血管瘤内皮细胞凋亡过程中PARP-1表达基因呈高表达。我们推测：平阳霉素诱导细胞凋亡的途径可能为：PARP-1可以修复受损DNA，当药物致DNA大量受损时，PARP-1的过度活化会使细胞能量储存耗竭，导致细胞凋亡。同时，PARP-1低水平的活化也可以使线粒体释放AIF和Cyt-c，从而导致细胞凋亡。

3.4 Cyt C在细胞凋亡中扮演的角色：Cyt-C由线粒体所释放，是一种可以导致细胞凋亡的细胞因子。细胞色素C是一种水溶性蛋白，由两种前驱分子组成，这两种分子均位于线粒体内外膜的间隙内，分别是：细胞核基因所负责的前细胞色素C（procytochrome C）和线粒体內合成的亚铁血红素（ferrohemoglobin）。亚铁血红素基团在细胞呼吸链中有重要作用，由于Cyt C具有此基团，因此可以在细胞色素还原酶及细胞色素氧化酶之间传递电子；当Cyt C缺乏时，这种电子的传递则会受阻，从而导致ATP合成的减少，进一步引起线粒体的能量供应障碍[15-17]。当线粒体外膜通道蛋白发生改变时，某些特异性凋亡因子则被释放出来。Cyt C自线粒体释放至细胞浆为诱导细胞凋亡的重要环节，由线粒体释放Cyt C介导活化Caspase-3引起细胞凋亡[18]。Cyt C自线粒体释放至细胞浆时，在ATP/dATP的协助下与两种重要的凋亡因子结合，分别为：前体凋亡蛋白酶9（procaspase-9）和凋亡蛋白酶活化因子-1（apoptotic protease activating factor-1：Apaf-1）。结合后的三者形成“Cyt C-Apaf-1-procaspase-9多聚体”，又称之为凋亡复合体（apoptosome）。这种凋亡复合体可以激活并生成caspase9，从而引发caspase级联反应，具体表现为caspase9诱导其他的caspase（主要是caspase3、caspase6、caspase7），这些执行者caspase引起细胞皱缩，DNA断裂并破坏细胞骨架，从而引发细胞凋亡。本实验发现平阳霉素诱导血管瘤内皮细胞凋亡过程中Cyt C表达基因呈高表达。

以上实验结果表明，平阳霉素诱导人血管瘤内皮细胞凋亡途径复杂，涉及多种因素，其中有线粒体凋亡相关蛋白：PARP-1及Cyt C参与。平阳霉素为治疗血管瘤的常用药物，可以在体外诱导人血管瘤内皮细胞发生凋亡，我们在实验结果中得到血管瘤内皮细胞凋亡过程中有线粒体途径参与。我们尚不知是否有其他的凋亡途径参与到血管瘤内皮细胞的凋亡。目前这方面的研究也并不完善，对于差异蛋白组中的未知蛋白的作用未能做深入研究，对这些未知蛋白在凋亡过程中发挥的作用深入研究，有助于我们深刻理解血管瘤的成因及凋亡机制，可能为血管瘤的治疗带来新的思路。

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[收稿日期]2012-08-25 [修回日期]2012-09-16

编辑/张惠娟