大麻素受体CB2在机械牵张力介导的人牙周膜细胞成骨分化中的作用

钱红 赵亚 胡静 闫英剑

[摘要]目的：研究大麻素II型受体（cannabinoid receptor II， CB2）在机械牵张力介导的人牙周膜细胞中的表达以及成骨分化中的作用。方法：体外培养人牙周膜细胞，构建细胞-机械牵张力加载模型，施加不同大小的机械牵张力，采用Real-time PCR和细胞免疫荧光化学技术检测CB2在人牙周膜细胞中mRNA和蛋白的表达。用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测机械牵张力介导的细胞ALP活性。结果：对人牙周膜细胞施加不同大小的机械牵张力24h，CB2 mRNA的表达随机械牵张力的力值增大而显著性增加（P<0.05），在18%拉伸应变率作用下表达量最高（P<0.05），此时CB2蛋白的表达显著增加。加入CB2激动剂HU-308后，施加18%拉伸应变率的机械牵张力作用于人牙周膜细胞24h，ALP活性显著性增加（P<0.05）。结论：CB2在人牙周膜细胞中的表达与机械牵张力的力值具有相关性。在机械牵张力作用下，大麻素受体CB2与其配体结合能够促进人牙周膜细胞的成骨分化，从而在正畸牙槽骨改建中发挥重要作用。

[关键词]大麻素II型受体；机械牵张力；成骨分化；牙周膜细胞

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）10-0-0

正畸治疗中，矫治器所施加的机械力首先作用于牙齿，然后传导至牙周膜，牙齿一侧的牙周膜受到牵张力，牙槽骨形成；另一侧牙周膜受到压力，牙槽骨吸收，从而发生牙槽骨改建，使错位的牙齿在牙槽骨内发生移动，到达正常位置[1-2]。牙周膜细胞是机械力的直接效应细胞，具有成骨样细胞表型，受到机械牵张力作用后首先发生成骨分化，进而形成牙槽骨，在正畸牙槽骨改建中发挥着极其重要的作用[3-4]。因此研究牙周膜细胞在机械牵张力作用下的成骨分化过程，对于深入了解正畸牙槽骨改建机制具有重要意义。但是，目前对于机械牵张力作用下牙周膜细胞发生成骨分化的机制仍未阐明。我们前期的研究证实：人牙周膜细胞表达大麻素II型受体（cannabinoid receptor II， CB2），CB2与其配体（CB2激动剂）结合能够促进人牙周膜细胞的成骨分化[5]，这提示我们：CB2很可能参与了机械牵张力作用下人牙周膜细胞的成骨分化过程。本实验进一步研究CB2在机械牵张力介导的人牙周膜细胞成骨分化中的作用。

1材料和方法

1.1 主要试剂和仪器：DMEM培养基 （Hyclone，美国）；胎牛血清 （FBS，Gibco，美国）；胰蛋白酶 （Gibco，美国）；FITC标记山羊抗兔IgG （Santa Cruz Biotechnology， 美国）；HU-308（Cayman Chemical， 美国）； SR144528（Cayman Chemical， 美国）；碱性磷酸酶（ALP）试剂盒 （南京建成生物制品公司）；CO2细胞培养箱 （Forma Scientific，美国）；YJ-875型超净工作台（苏州净化设备厂）；倒置相差显微镜及照像系统 （Olympus，日本）；Flexercell Strain Unit （Flexcell International，美国）；ABI 7500 Fast Real-time PCR System （Applied Biosystems， 美国）。

1.2人牙周膜细胞的体外培养和鉴定：取11～14岁青少年因正畸拔除的牙周健康的双尖牙。采用组织块法原代培养人牙周膜细胞，取第2代细胞爬片，用免疫组化SP法进行波形丝蛋白和角蛋白染色，进行来源鉴定。证明细胞为间叶来源后，取第3～5代细胞用于实验。

1.3人牙周膜细胞的体外加力：采用细胞机械牵张力加载装置Flexercell Strain Unit，构建人牙周膜细胞-力学加载模型。对细胞加载24h的机械牵张力，力值分别为0%、6%、12%、18% 拉伸应变率，频率为6循环 / min，每循环包括5s拉伸，5s松弛。

1.4 Real-time PCR检测机械牵张力作用下CB2 mRNA在人牙周膜细胞中的表达

1.4.1 总RNA提取：在弹性培养皿中加入lml Trizol，吹散，收集细胞于1.5ml Ep管内，震荡30s后加入0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min，12 000g，4℃离心，l5min，吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。加等体积异丙醇，-20℃，30min。12 000×g，4℃ 离心，10min。在管底部可见微量RNA 沉淀。弃上清，加75%乙醇lml，振荡。7 500×g，4℃ 离心，10min。弃上清，用滤纸吸取残留液体，室温干燥 5～10min。沉淀溶于20μl DEPC水，取1μl加入79μl DEPC水，测OD260/OD280计算浓度与纯度，-70℃保存。逆转录合成cDNA。

1.4.2 Real-time PCR实验：引物设计见表1，Real-time PCR 根据QuantiTect SYBR Green PCR 试剂盒手册进行。反应混合液（25L）预先在95℃放置l5min以激活热启动Taq酶，然后95℃变性30s，95℃退火5s，60℃延伸30s，共40个循环。其中内参l8s-rRNA同样进行Real-time PCR扩增。采用△ △Ct方法计算每个样品目的基因与内参的比值作为目的基因的mRNA表达。

1.5 细胞免疫荧光化学技术检测机械牵张力作用下CB2 蛋白在人牙周膜细胞中的表达：将长有细胞的玻片放于玻璃器皿内，冷丙酮固定，0.5%Triton-X 100的PBS透化，正常山羊血清封闭，滴加用抗体稀释液稀释的兔抗人CB2一抗（1：100），湿盒中4℃过夜，漂洗后滴加用FITC标记的山羊抗兔二抗（1：500），暗室中在室温孵育30～60 mim，PBS彻底漂洗，90%甘油封片。荧光显微镜下进行观察。

1.6 用ALP试剂盒检测加入CB2激动剂HU-308和/或CB2抑制剂SR144528后，机械牵张力介导的人牙周膜细胞ALP活性：取生长状态良好的细胞，2.5g/L 的胰蛋白酶消化后，用含50ml/ FBS的DMEM培养液配成单细胞悬液，以每孔103细胞接种到96孔板上，每孔体积为200μl，次日去除未贴壁死细胞，换含10ml/L FBS的DMEM培养液，分别加入10-7M CB2激动剂HU-308和/或1μM CB2抑制剂SR144528，然后施加18%拉伸应变率的机械牵张力24h，采用ALP试剂盒检测ALP活性。

1.7 统计分析：采用SPSS12.0统计软件包对数据进行单因素方差分析和t检验，P<0.05认为有显著性差异。

2结果

2.1 CB2 mRNA在人牙周膜细胞中的表达：Real-time PCR结果见图1。结果显示，施加不同大小的机械牵张力作用于人牙周膜细胞24h，CB2 mRNA的表达随机械牵张力的力值增大而显著性增加（P<0.05），在18%拉伸应变率作用下表达量最高（P<0.05）。

2.2 CB2 蛋白在人牙周膜细胞中的表达：细胞免疫荧光化学技术检测结果见图2。结果显示，施加18%拉伸应变率的机械牵张力作用于人牙周膜细胞24h，CB2 蛋白的表达显著增加。

3.3 机械牵张力作用下，人牙周膜细胞ALP活性：如图3所示，加入CB2激动剂HU-308后，施加18%拉伸应变率的机械牵张力作用人牙周膜细胞24h， ALP活性显著性增高（P<0.05）；然后再加入CB2抑制剂SR144528，ALP活性显著性降低（P<0.05）。

3讨论

内源性大麻素（canabinoid，CB）系统包括大麻素受体、其内源性配体以及大麻素合成、降解酶。生物体内存在大麻素I型受体（cannabinoid receptor I，CB1）和大麻素II型受体CB2，这两型大麻素受体都属于G蛋白耦联受体。CB1主要分布在中枢神经系统，包括大脑与脊髓；而CB2主要分布于外周[6]。近几年来骨代谢研究领域最重要的发现之一是证实骨组织内存在着内源性大麻素系统。CB2与其配体（CB2激动剂）结合通过以下机制维持骨量：①直接促进成骨细胞分化及功能表达；②直接抑制破骨细胞分化及功能表达，或通过抑制成骨细胞表达的破骨细胞分化因子（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）来间接抑制破骨细胞[7]。

我们前期的研究结果证实：人牙周膜细胞表达大麻素受体CB2。CB2与其配体结合能够促进人牙周膜细胞成骨标志物的表达，从而证明： CB2能够促进人牙周膜细胞的成骨分化[5]。本实验进一步研究了机械牵张力对CB2在人牙周膜细胞中表达的影响以及CB2在机械牵张力介导的人牙周膜细胞成骨分化中的作用。

本实验发现：CB2在人牙周膜细胞中的表达与机械牵张力的力值具有相关性。这说明CB2是一种对机械牵张力敏感的基因，那么它在机械牵张力介导的牙槽骨改建中究竟发挥什么作用？进一步的实验发现：在机械牵张力作用下，CB2与其配体（CB2激动剂）结合能够增加ALP活性。ALP广泛分布于体内几乎所有器官，是骨形成所必需的酶，通过水解磷酸酯、破坏矿化抑制剂及作为钙结合蛋白和磷酸基的转运子而促进矿化。作为生物矿化和成骨样细胞的一种特征性标记，其活性的高低可反映相应细胞向成骨方向分化的趋势。以往的研究发现：人牙周膜细胞在机械牵张力作用下ALP活性升高，成骨标志物表达增加[3-4]。因此，本实验结果说明：在机械牵张力作用下，CB2与其配体结合能够促进人牙周膜细胞的成骨分化，从而在正畸牙槽骨改建中发挥重要作用。目前国内外的研究仅限于大麻素系统对骨代谢的调控作用和牙周炎时促进牙周组织愈合的作用[7-10]，关于CB2在机械牵张力作用下人牙周膜细胞成骨分化中的作用尚未见报道。我们将继续深入地进行研究，以期为完善正畸临床理论以及相关骨生物力学理论作出贡献。

[参考文献]

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[收稿日期]2012-08-25[修回日期]2012-09-21

编辑/张惠娟