核桃青果皮系统溶剂提取物抑菌作用研究

龚斌荣,刘华英,司杰

摘要：以苯甲酸钠为对照组，分别研究核桃青果皮的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水提取液对几种常见食品微生物的抑菌效果。结果表明，核桃青果皮提取液对细菌具有较强的抑制作用，啤酒酵母次之，乙酸乙酯和石油醚提取物的抑菌效果优于其它溶剂。

关键词：核桃青果皮；提取；抑菌

中图分类号：S664.1文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.02.014

Study on Bacteriostasis of Systematic Solvents Extracts from Walnut Green Peel

GONG Bin-rong1,LIU Hua-ying2，SI Jie3

(1.The Experiment Forest Station of Akesu region, Akesu, Xinjiang 843000,China; 2.College of Life Sciences, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300,China;3.Afforestation Centre of Logistical Administration Office, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300,China )

Ａｂｓｔｒａｃｔ: The bacteriostasis of systematic solvents extracts from walnut green peel was studied.Six systematic solvents extracts were conducted for the inhibitory effects against food spoilage.The results showed that the extracts from walnut green peel could effectively inhibit the growth of bacteria. The petroleumether and acetate extract had stronger effects than other solvents.

Key words: walnut green peel；extract；bacteriostasis

随着生活水平的提高,健康意识的增强, 人们对天然无公害、无污染产品的需求越来越多。从这一目的出发, 国内外学者对天然产物提取成分在抗菌、抑菌方面作了许多工作, 其中从资源丰富的植物中寻找高效低毒的杀菌、抑菌成分,并由此开发无公害植物源杀菌剂, 已成为该研究领域的方向和热点[1]。

核桃（胡桃）是我国分布较广的重要树种之一，在新疆亦有大面积种植，主要集中在南疆的和田、墨玉、叶城、温宿4个县区，产量大且品质高[2]。核桃青果皮是采收核桃时的废弃物[3]，含有如鞣酸质、胡桃醌、胡桃甙、柠檬烯、香豆素、黄酮体等[4]多种生物活性物质。目前, 有关核桃青果皮提取物的提取及抗菌活性方面的研究较少。笔者以核桃青果皮为原料，以其提取物为研究对象，对其抑菌作用作进一步探讨，确定提取物最低抑菌浓度，旨在为进一步开发利用南疆核桃资源，增加其附加值，提供一条新的途径。

1材料和方法

1.1材料

核桃青皮采自新疆阿克苏核桃产区，在45 ℃左右的烘箱中烘干，粉碎过0.177 mm筛，然后密封于塑料袋内，置冰箱中备用。

细菌：枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌；真菌：黑曲霉、青霉；啤酒酵母。以上供试菌种由塔里木大学生命科学学院菌种保藏实验室提供。

1.2仪器与药品

95%乙醇、四氯化碳、石油醚（30～60 ℃）、丙酮 、乙酸乙酯、正丁醇、氯化钠均为分析纯； 琼脂粉、酵母膏、葡萄糖、牛肉浸膏、蛋白胨均为生化试剂。

HYP-150 粉碎机、 RE-201D旋转蒸发仪、SHB-B95A型循环水式多用真空泵、101-5ARS 电热鼓风干燥箱、DL-1 电子万用炉、BL2200H 电子天平、SPX-250C 恒温恒湿培养箱、LDZX-40BI 立式自动压力蒸汽灭菌器 。

1.3方法

1.3.1待测样品的制备称取一定质量核桃青皮粗粉置于回流装置中，以95%乙醇为提取溶剂在70 ℃水浴中回流提取3次（3 h→2 h→2 h），每次加入500 mL95%乙醇回流，合并3次提取液进行减压浓缩至浸膏状, 留少部分醇提物稀释后直接用于抑菌试验，剩余部分萃取用。称取核桃青皮乙醇提取物浸膏10 g加入少量蒸馏水，装入分液漏斗中混匀后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取4次(50 mL·次-1)（图1）。分别合并各萃取液，减压浓缩至浸膏状。

1.3.2菌种的活化及菌悬液的制备预先将供试菌种用适宜的培养基进行活化, 细菌在37 ℃培养24 h，霉菌和酵母菌在28 ℃培养48～72 h。量取10 mL无菌水于试管中, 然后再将活化好的菌种用接种针挑取3～4环，将菌苔放入无菌水中,充分振荡摇匀, 得菌悬液备用。

1.3.3抑菌试验在超净工作台上将灭菌后的培养液倒入无菌培养皿中，每皿15～20 mL。待冷却凝固后, 用无菌移液管吸取1 mL菌悬液到平皿上, 用涂布棒将菌悬液轻轻涂匀，取灭菌的打孔器在每皿上打孔，用移液枪吸取25 μL提取液注入小孔，每一样品重复3次，同时各菌种用蒸馏水、95%乙醇做一组空白对照。将细菌置37 ℃恒温箱中培养24 h，真菌置28 ℃培养48～72 h，做好标记。待培养时间到后，观察菌种的生长情况，测量抑菌圈的直径，取平均值。

1.3.4最小抑菌浓度(Mic)的测定无菌条件下，将提取液原液用无菌水稀释, 得50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%、1.563% 6个浓度梯度, 在各平皿内分别加入2 mL不同浓度的提取液, 每个浓度3个重复, 然后倒入10～12 mL培养液(细菌培养用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,真菌培养用马铃薯琼脂培养基), 充分混匀, 冷却凝固后, 用移液枪移取1 mL菌悬液于平皿中，用涂布棒涂抹均匀，将细菌置37 ℃恒温箱中培养24 h，真菌置28 ℃培养48～72 h，做好标记，待培养时间到后，观察菌种的生长情况。

2结果与分析

2.1核桃青皮系统溶剂提取物的提取率

本试验采用冷浸法,以最大限度保留其活性成分,从表1数据可以看出，核桃青果皮乙醇提取物中石油醚、乙酸乙酯提取率相对为16.09%、10.79%，说明有很大一部分活性物质能够溶于石油醚、乙酸乙酯并被其萃取，同时也说明核桃青皮中的活性物质极性较小。

2.2系统溶剂法萃取液抑菌效果比较

从表2可以看出，系统溶剂法回流萃取液中，95%乙醇提取液粗提物除对啤酒酵母无抑菌效果外，对细菌有较好的抑菌效果，对青霉和黑曲霉抑菌效果较差；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取液中，石油醚萃取液和乙酸乙酯萃取液对6种供试菌均有抑制效果，石油醚萃取液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌抑制效果显著，抑菌圈直径为33.5 mm，对金黄色葡萄球菌抑制效果强烈，抑菌圈直径达到了35.5 mm；乙酸乙酯萃取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌抑制效果显著，抑菌圈直径分别为28.5 mm、27.5 mm和30.5 mm，对3种真菌抑制效果一般；正丁醇萃取液对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制效果较好，对枯草芽孢杆菌抑制效果一般，对青霉效果略微，其他无抑制效果；水相均无抑制效果。

2.3最小抑菌浓度(MIC)的确定

此项试验中，依据表2萃取相抑菌效果的试验，选择抑菌效果最好的石油醚来做最小抑菌浓度试验。从表3可以看出，石油醚萃取液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度为12.5%；对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为6.25%；对青霉最小抑菌浓度为50%;对黑曲霉基本没有抑菌作用；对啤酒酵母最小抑菌浓度为100%。本项试验更证明了核桃青皮提取液对细菌的抑菌效果要比真菌好。

3结 论

在系统溶剂中，极性由小到大顺序依次是石油醚＜乙酸乙酯＜正丁醇＜丙酮＜乙醇＜水，极性最小的是石油醚，该提取物中物质的极性也最低，从对6种对象菌的抑制作用看，石油醚萃取物有最强抑制作用，对3种细菌的抑制作用明显好于对3种真菌的抑制作用，而极性最大的水提物对6种对象菌基本无抑制作用，而95%乙醇提取物对6种供试菌有较其他提取液较好的抑菌效果。6种核桃青皮系统溶剂提取萃取物中， 核桃青皮系统溶剂提取物对3种霉菌具有一定的抑制效果，但总体来看，核桃青皮的提取物对真菌抑制效果明显不及对细菌的抑制效果。采用系统溶剂法获得核桃青皮提取物可以实现对其中具有抑菌作用的成分的初步分离。

参考文献:

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