Hsp90α促进慢性难愈性创面愈合作用研究进展

王芳 栗勇 　苏映军

慢性难愈性创面，简称慢性创面，系指临床治疗4～6周以上的难愈合或不愈合创面。多由静脉曲张、糖尿病、动脉炎、动脉硬化、神经系统疾病及肿瘤等引起。据统计，全世界约有1%的人口被持续性的创面问题所困扰，约5%的医疗费用花费在创面修复上。在美国，每年在慢性糖尿病创面愈合治疗方面的费用已超过250亿美元[1]。而我国，据统计仅糖尿病所致慢性创面患者就达4 000万例。随着人口老龄化和糖尿病、下肢静脉溃疡等发病率的不断上升，难愈性创面的发生率也越来越高[2]；由于缺乏有效的治疗，这将发展为严重的社会问题，因此探索创面愈合机制及寻找一种高效经济的治疗方法显得十分迫切。

正常创面愈合过程可大致分为三个阶段：局部炎症反应阶段、细胞增殖分化阶段和组织塑形重建阶段。创面愈合的病理生理机制是一个动态有序且复杂的过程，但在各种系统或局部因素作用下，这种有序的过程被破坏，导致了慢性难愈创面的发生。造成此种破坏的因素归纳起来主要有以下五点：①营养不良；②组织灌注不良和缺血再灌注损伤；③细菌负荷、感染和坏死组织存留；④糖尿病；⑤细胞衰老。在上述因素的影响下，创面修复能力被削弱，而以损伤因素为主导，最终导致了难愈创面的形成。

1创面愈合的治疗方法

迄今为止，在慢性难愈性创面的治疗方面，临床上尚缺乏非常有效的方法。19世纪初发明的封闭负压引流技术（vacuum assisted closure， VAC）至今仍为临床所用，但该治疗方法的禁忌证广泛，治疗效果也存在较多争议[3]；创面应用敷料治疗技术，目前已有各种成熟的产品，但其对面积大，损伤程度较深的创面，效果仍然有限[4]；高压氧治疗，该方法虽已被证实能够有效改善创面生长环境，促进肉芽组织的形成，然而其体积庞大，成本较高，临床疗效一般，且禁忌证较多；基因治疗虽然取得了一定成绩，然而多数仅局限于细胞及动物实验，且其安全性问题尚待研究[5]；干细胞移植虽然应用于动物正常创面可以加速愈合，但是应用于慢性创面的动物模型及临床的效果却并不理想且成本较高[6]；手术治疗的效果并不确切，也为患者带来较大的痛苦及负担；而中医复方药具有多靶点多途径的复合作用等特点，且价格低廉、使用方便、适用广泛，但是其在创面愈合方面的作用机制却未能得到科学深入的阐述而影响了它的推广应用。

过去的30多年，血清中的生长因子被普遍认为是创面愈合的始动因素：丝裂原和运动因子，如：表皮生长因子/转化生子因子 （EGF/TGF ），角质细胞生长因子（KGF），白介素-1（IL-1）等能够促进角质形成细胞的迁移及上皮化而促进创面愈合；血小板源性生长因子（PDGF-BB）和/或血管内皮生长因子（VEGF）等能够诱导成纤维细胞和血管内皮细胞迁移，促进创面纤维增生和新生血管形成[7-8]。自从1989年EGF第一次被报道用于创面愈合临床实验研究以来，许多生长因子也相继用于创面愈合临床实验；研究报道大部分生长因子在创面愈合中都有作用[9-10]，最终却只有PDGF-BB被美国FDA批准用于临床治疗[11-12]。然而，研究发现PDGF-BB用于创面治疗疗效低、花费高、副作用大等，临床应用受限[13]。这表明血清中的生长因子可能并不是创面愈合中促进细胞迁移的来源，使得传统的观念认为生长因子是促进创面愈合的主要驱动力量受到质疑和挑战[14]。

2Hsp90α与创面愈合

2.1 HSP90α的发现：胎牛血清常被用于创面愈合的各种细胞培养，但研究发现在培养的细胞并不与胎牛血清真正的融合，在创面中也是悬浮于血清中。通过观察胎牛血清及人血清对创面愈合所需的三类细胞即角质形成细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞的迁移作用比较，发现胎牛血清能够同等地促进三类细胞的迁移；而人血清只能促进角质形成细胞的迁移，对成纤维细胞和血管内皮细胞的迁移没有作用。进一步的研究发现人血清中的TGF-β3 是导致其不能促进真皮细胞迁移的原因。由于血清中丰富的TGF-β3，生长因子如PDGF-BB等不能够诱导成纤维细胞和血管内皮细胞的增殖和迁移，因此，临床应用中效果不如体外实验明显。通过对损伤后创面中促使愈合的细胞及分子的研究，研究者发现了热休克蛋白90α（heat shock protein 90α， HSP90α），其不仅能够同等地促进创面愈合所需三类细胞的迁移，更重要的是，即使在TGF-β3大量存在的创面中，HSP90α促进细胞迁移的作用并不受影响[15]。因此，HSP90α作为一个新奇的因子，成长了创面愈合研究领域的新观念。

2.2 HSP90α及F-5的作用：体外研究表明在低氧等应激状态下，角质形成细胞和成纤维细胞分泌Hsp90 至胞外，当这些分泌的Hsp90 迅速聚集达到一个μM的浓度时，会反过来促进细胞的迁移。在小鼠背部全层创面使用重组的HSP90α后，其促进创面愈合的速度比安慰剂快约60%，是PDGF-BB的3倍；而在糖尿病小鼠背部创面运用重组HSP90α后，糖尿病创面愈合的速度明显优于PDGF-BB。 HSP90α的作用在创面愈合过程中是必不可少的[16-18]。

从治疗角度来说，蛋白中小片段的、稳定且具有同样效应的短肽由于具有高度特异性以及低耗能，因此，比全长的氨基酸片段更容易通过GMP生产管理，故不同长度的HSP90α的截短体也由此而生。通过体外实验发现含有115个氨基酸（处于HSP90α的中间区域与链接区域）的截短体F-5，是目前与全长的HSP90α有同样的促进细胞运动的最小的氨基酸片段。体内试验表明F-5加速创面愈合的速度优于PDGF-BB， 并且主要是通过促进上皮化来实现的；而对于糖尿病创面F-5的作用优势更甚于普通创面，也优于PDGF-BB；F-5能够将糖尿病小鼠创面愈合的时间由35天缩短至14～18天，并且不是通过血管化或是创面的收缩完成[17]。

2.3 HSP90α及F-5的特性：HSP90α及F-5具有以下特性，因此其促进创面愈合的作用优于生长因子 [17]：首先，HSP90α及F-5是一个公共的能动性因子；即HSP90α及F-5能够同等地促进3种创面愈合所需的皮肤细胞（表皮角质形成细胞，真皮成纤维细胞和血管内皮细胞）的迁移。皮肤受损后，首先角质形成细胞的横向移动使创口闭合，之后成纤维细胞和血管内皮细胞迁移至基底修复受损组织及重建血管。因此，一个理想的创面愈合因子应该具有募集创面愈合所需三类细胞的能力，由于创面愈合所需的三类皮肤细胞都能表达不同水平的LRP-1受体 [16]，所以，HSP90α具有此特性。而如果某个因子只能够对某一类细胞起作用，其对创面愈合这个需要多种细胞参与的过程效果将明显降低，如生长因子 PDGF-BB，只有成纤维细胞表面能够表达PDGF受体，所以它只能促进成纤维细胞的迁移。假设体外研究结果与创面愈合过程相类似，那就说明PDGF-BB对表皮角质细胞的上皮化和真皮微血管内皮细胞的血管化并没有直接的影响；其次，HSP90α及F-5是一个TGF 抵抗因子；由于细胞表面作用的受体具有选择性，PDGF-BB不能够抵抗创面中TGFβ3的抑制作用刺激成纤维细胞迁移，因此，在临床应用中效果并不明显。然而即使在TGFβ3存在的情况下，HSP90α及F-5同样能够有效地促进三类细胞的迁移，但具体作用机制尚待研究；第三，HSP90α及F-5是一个高糖抵抗因子，各种类型的糖尿病都是以血液循环中慢性高血糖为特征，这也是糖尿病创面愈合延迟的主要原因之一[19]。在创面愈合过程中，缺氧诱导因子1α（hypoxia induced factor-1α，HIF-1α）是调节HSP90α分泌的一个关键因子，有报道说明高糖能够损害HIF-1α的稳定性 [20-21]。Cheng等[17]最近研究发现高糖能够抑制低氧和血清刺激成纤维细胞迁移的作用，而HSP90α及F-5不仅能够增强在正常血糖水平低氧促进细胞迁移的作用，而且可以拯救高糖状态下低氧抑制培养的细胞的迁移。这说明HSP90α及F-5促进糖尿病创面的愈合是由于越过了高糖导致的HIF-1α的下调并启动了细胞的迁移。

基于以上特性，一个新的创面愈合的程序被提出来，并且对驱动表皮和真皮细胞的迁移做出了说明：在受伤之前，皮肤中的HSP90α，TGF-β3和细胞的运动性是保持在最低限度的；受伤后数小时内，角质形成细胞开始水平移动（可能是受到急性缺氧或是血清中TGF-α的诱导），此时，创缘的成纤维细胞和血管内皮细胞由于血清中TGF-β的存在并不能立即向创面基底移动；迁移的角质形成细胞开始分泌HSP90α，当分泌的HSP90α达到100nM的阈值时[22]，即使在TGF-β存在的条件下，成纤维细胞和血管内皮细胞开始从创缘周围迁移至创基；最后角质形成细胞完全闭合创面，成纤维细胞修复受损组织，血管内皮细胞重建新的血管。组织的重建和血管的新生需要几月才能完成，因此，角质形成细胞分泌的HSP90α替代了血清中的生长因子，可能真正的募集真皮细胞进入创面的因子。

最后，Hsp90α及F-5是一个运动因子而非丝裂原（不能促进细胞的增殖） [23]，这是因为：①角质形成细胞的迁移在皮肤损伤后立即发生，而真皮细胞的迁移至少4天以后才能被监测 [24] ；②当某个细胞正向着创面区域迁移时，这个细胞并不能同时增殖；局部受损组织所释放的生长因子刺激表皮和真皮细胞的增殖将会被创面周围的TGF-β家族细胞因子所抑制[15，17]；③在创面愈合过程中，细胞的迁移优先于细胞的增殖。当创缘的细胞向基底迁移时，这些细胞给它们自己及其后的细胞留下了空间，当与前面移动的细胞失去接触抑制作用后，后面的这些细胞才开始增殖。细胞增殖的刺激最可能来自于周围没有被损伤的血管中的生长因子，因为这些血管中的TGF-β水平很低甚至缺乏。增殖的细胞重新填满迁移细胞留下的空间而完成创面愈合过程。因此，Hsp90α的作用是尽可能快地促进最初创口的关闭，预防感染及水分丢失，缓解外环境的应激。

3结语和展望

慢性难愈性创面是外科常见疾病，病因繁多、病理复杂，组织再生能力差，治疗困难。HSP90α的发现挑战了传统的创面愈合观念，为难愈性创面的治疗提供了一个更有效、更安全的因子，对HSP90α的作用及其机制的进一步研究，会有利于我们更深入地了解创面愈合的相关机制，为难愈性创面的治疗提供新的思路。

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[收稿日期]2012-08-20[修回日期]2012-10-08

编辑/李阳利