肠易激综合征大鼠肠神经系统内γ—氨基丁酸及其受体的表达

陈鹏　胡立华　张艳杰　常英娟　张鉴颖

[摘要] 目的 通过研究γ-氨基丁酸（GABA）及其受体在便秘型肠易激综合征（C-IBS）大鼠模型肠神经系统中表达的变化，探讨GABA在肠易激综合征（IBS）发病机制中的可能作用。 方法 通过0～4℃冰水灌胃方法建立C-IBS大鼠模型，分别取模型组和正常对照组大鼠的回盲部以及距肛门3cm处结肠的标本，进行灌注、固定、切片。用抗谷氨酸脱羧酶（GAD）、GABAA受体、GABAB受体抗体进行免疫组织化学染色，应用病理图像分析系统对不透光率密度值进行半定量分析。 结果 与正常大鼠相比，C-IBS大鼠模型回盲部及距肛门3cm处结肠肌层中GAD免疫反应性明显降低（P < 0.05），GABAA受体免疫反应性无明显变化（P > 0.05），GABAB受体免疫反应性明显降低（P < 0.05）。 结论 GABA可能通过其受体间接地参与IBS的病理生理过程。

[关键词] 肠易激综合征；肠神经系统；γ-氨基丁酸；γ-氨基丁酸受体

[中图分类号] R574.4[文献标识码] B[文章编号] 1673-9701（2012）21-0015-03

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是由腹部不适或腹痛伴排便异常组成的一组肠功能障碍性综合征，目前发病原因尚不清楚，缺乏有效的治疗方法[1]。肠神经系统（enteric nervous system，ENS）是胃肠壁内的自主神经系统，具有独立于大脑而行使其功能的完整结构。ENS中含有多种神经递质，近年来的研究结果表明在IBS动物模型的肠神经元VIP、SP等神经递质表达增强[2]，而IBS患者血中NO、5-HT、SP[3，4]等也发生了变化，提示ENS中的神经递质与IBS的发病机制存在一定关系。γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是中枢神经系统内重要的抑制性神经递质，通过受体（包括GABAA、GABAB、GABAC等亚型）发挥重要的调节作用。谷氨酸脱羧酶（glutamic acid decarboxylase， GAD）为GABA合成过程中的关键酶，被认为是GABA能神经元的特异性标记酶。但迄今为止，关于GABA及其受体在肠易激综合征中的表达变化尚不清楚。本研究利用冰水洗胃方法建立的便秘型肠易激综合征（C-IBS）大鼠模型[5]，应用免疫组织化学方法及图像分析系统半定量分析对正常及C-IBS大鼠ENS内GAD、GABAA受体、GABAB受体的表达变化进行研究，以探讨GABA在IBS发病过程中的可能作用。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立

SD大鼠10只，雌雄不拘，体重200～250 g，由第四军医大学实验动物中心提供，随机分为两组，模型组5只，每日给予0～4℃冰水２ mL灌胃１次，共14 d，灌胃停止后正常饲养。正常对照组5只，每日正常进食饮水饲养，第28天取材。

1.2 取材

动物用戊巴比妥钠（100 mg/kg体重）行腹膜腔深麻后，开胸经左心室插管至升主动脉，先以150 mL的0.025 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.3）快速冲洗血液，再以500 mL含4%多聚甲醛和0.5%苦味酸的0.1mol/L磷酸缓冲液（PBS，pH7.3）灌注固定1.0～1.5 h。灌毕立即取回盲部、距肛门3 cm处的结肠各0.5 cm，并置入含25%蔗糖的0.05mol/L的PBS过夜（4℃），恒冷箱切片。

1.3 免疫组织化学染色

切片经0.05 mol/L PBS（pH7.3）洗3次后，分别进行GAD、GABAA受体、GABAB受体免疫组织化学染色。首先分别用小鼠抗GAD IgG（1：500，Chemicon）、羊抗GABAA受体α3 IgG （1：500，Alamone Labs）、小鼠抗GABAB受体IgG（1：500，Chemicon）抗体在室温下孵育切片过夜，然后分别将切片移入生物素标记的羊抗小鼠IgG（1：100，Vector）、生物素标记的驴抗羊IgG（1：100，Vector）和生物素标记的羊抗小鼠IgG（1：100，Vector）中孵育4 h，最后移入ABC复合物（1：100，Vector）室温下孵育4 h。其中一抗和二抗用含5%驴血清、0.05%叠氮钠、0.5% Triton X-100和0.25%角叉菜胶的0.05 mol/L的PBS稀释，ABC用含0.3% Triton X-100的0.05 mol/L的PBS稀释。上述反应完成后的切片进行DAB和H2O2呈色，然后裱片，脱水透明，DPX封片。

1.4 染色结果分析

应用计算机病理图像分析系统，对切片中各抗体不透光率密度（opacity density， OD）进行半定量分析。OD值代表组织染色强度，即OD值越大，染色越强 。每张切片随机取两个视野进行分析，取平均值。

1.5 统计学处理

所有数据以（x±s）表示，采用SPSS 12.0统计学软件进行多组间比较，采用单因素方差分析，各组间两两之间的多重比较采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

①正常大鼠和IBS模型大鼠回盲部及结肠肌层中GAD主要阳性部位是肌间神经丛，呈较强的棕黄色反应，其中神经纤维染色比神经元胞浆染色更浓，GAD样阳性神经元胞体约占肌间神经丛神经元的10%左右。IBS模型组回盲部及距肛门3 cm处结肠的GAD免疫反应性均较正常对照组明显降低（P < 0.05）。②正常大鼠和IBS模型大鼠回盲部及结肠肌层中GABAA受体主要阳性部位是肌间神经丛，呈较强的棕黄色反应，其中大部分为神经纤维染色。IBS模型组回盲部及距肛门3 cm处结肠的GABAA受体免疫反应性均与正常对照组差异无统计学意义（P > 0.05）。③正常大鼠和IBS模型大鼠回盲部及结肠肌层中GABAB受体主要阳性部位是肌间神经丛，呈较强的棕黄色反应，其中大部分为神经纤维染色。IBS模型组回盲部及距肛门3 cm处结肠的GABAB受体免疫反应性均较正常对照组明显降低（P < 0.05）。见表1。

3 讨论

IBS是一种临床最常见的慢性肠功能紊乱疾病，该病缺乏可解释症状的形态学改变和生化异常，其发病率全球约15%～20%，且多见于女性[1，6]。IBS临床表现复杂，呈多样性，常以结肠症状为主，也可表现为其他消化道症状甚至躯体症状。目前IBS的病因尚未完全明了，其涉及因素较多，如肠道运动异常、内脏感觉异常、脑肠相互作用、神经免疫机制等。

ENS由肠道肌间神经丛和黏膜下神经丛组成， 肌间神经丛主要控制胃肠道运动，而黏膜下神经丛主要控制胃肠分泌和局部血流[3，4]。目前发现人肠神经元的总数达到8～10亿个，相当于整个脊髓内所含神经元的总数，称之为肠脑。ENS内含有多种神经递质，包括经典的神经递质和脑肠肽等，已经证实的多达数十种。有些递质与其他递质共存，有些递质还以胃肠激素的形式发挥作用，肠神经递质的多样性决定了功能的复杂性。目前认为主要的兴奋性递质有乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）、P物质、阿片肽和5-羟色胺等[7]，主要的抑制性递质为一氧化氮（nitric oxide，NO）和血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）等[8]。近年来的研究发现，在IBS患者和动物模型的ENS内，一些神经递质的含量发生了变化[2～4，9]，提示ENS可能通过这些神经递质参与了肠道功能失调的发生。

我们既往的研究证实，GABA在ENS内分布的数量要少于Ach、NO和VIP，并且与上述三种神经递质均有共存（待发表）。在ENS中Ach被认为是主要的兴奋性神经递质，而NO和VIP则为主要的抑制性神经递质，GABA这种既与兴奋性神经递质共存又与抑制性神经递质共存的形式提示GABA可能不是直接作用于效应器，而是通过促进或抑制其他递质而对胃肠动力的兴奋和抑制发挥协调作用。本实验结果表明，大鼠ENS内GABA及其受体主要分布在肌间神经丛，与正常大鼠相比，C-IBS大鼠模型回盲部及距肛门3 cm处结肠肌层中GAD免疫反应性明显降低（P < 0.05），GABAA受体免疫反应性无明显变化（P > 0.05），GABAB受体免疫反应性明显降低（P < 0.05）。GABA在大鼠IBS模型中表达的减少，提示了参与IBS发病的可能。由于GABA主要存在内在神经元中，而且其在胃肠动力过程中发挥间接地协调作用，因而我们推测GABA在协调肠道兴奋性和抑制性作用方面发生了失衡，而参与了IBS的发病过程。GABAA受体是配体门控的氯离子通道，而GABAB受体属于G蛋白偶联受体，激活后可通过胞内信号转导系统调制离子通道的活动，二者在ENS中均有表达，说明了GABA调控作用的复杂性。在IBS动物模型中GABAA受体没有明显变化，而GABAB受体则表达减少，提示GABA参与IBS发病过程可能主要通过GABAB受体这一途径实现的。综合我们的实验和其他研究[2，10，11]，我们推测在正常肠道中GABA通过不同受体调节不同共存递质的释放而在胃肠动力的兴奋与抑制中发挥协调作用，在IBS动物模型中，由于GABA及GABAB受体的减少，使GABA在协调肠道兴奋性和抑制性作用方面发生失衡，从而参与了IBS的发病过程。对于GABA在IBS发病机制中的具体过程尚需大量的研究工作来证实。

[参考文献]

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（收稿日期：2012-05-21）