血清醋酸纤维薄膜电泳实验常见的问题分析

摘要： 本文阐述了血清醋酸纤维薄膜电泳实验中电泳图谱常见的问题，并对产生这些问题的原因进行了分析，以期为生物化学实验教学提供参考。

关键词： 血清醋酸纤维薄膜电泳生物化学实验

电泳是带电颗粒在电场的作用下，向着与带电颗粒电性相反的电极迁移的现象。电泳法可用于分离、鉴定或提纯许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等，因此电泳法已成为开展生物化学和分子生物学研究工作的一种常规的不可缺少的工具。电泳法(血清醋酸纤维薄膜电泳分离及测定)作为一项基本方法，已成为医学生生物化学实验教学常规开设的实验内容，该法操作简便，快速、价廉，样品用量少，实验技术成熟，分辨能力强，没有吸附现象、效果直观，便于保存等优点，但影响电泳图谱的因素较多，学生在实验中操作不当等，均可导致实验失败而得不到理想的电泳图谱。因此，为了达到预期的实验效果、提高学生对电泳实验的动手能力，根据我校学生血清醋酸纤维薄膜电泳（cellulose acetate membrance electrophoresis，CAME）实验的实际情况，本文对CAME实验中电泳图谱常见的问题进行分析，以期为CAME实验教学提供参考。

1.出现五条以上的区带

在CAME实验中，有的同学电泳实验结果看起来很“完美”，有“许多”区带——五条以上（实验结果应是五条区带，分别是清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白），为什么会有这种现象呢？原来出现的“许多”区带（五条以上）正是在点样中出现的，有的同学在点样过程中实施“二次”点样［１］。CAME实验包含准备、点样、平衡、电泳、染色、漂洗、定量（该步骤没要求）等步骤，其中点样成功是获得清晰电泳图谱的关键。在试验中，为了便于学生操作，我们应用玻片进行点样，有的同学没有擦干玻片两侧的血清；有的同学觉得点样量太少，又重复进行一次点样。没擦干玻片两侧的血清，导致玻片两侧有两个点样面，后者进行的“二次”点样不可能在同一个位置，在进行电泳时，有的区带“跑”得快，有的“跑”得慢，区带与区带之间有的重叠，有的未重叠，因而分离出五条以上的区带（事实上，在某一区带并不是同一种蛋白质）；有的同学进行多次（两次以上）点样所得到的电泳图谱成片。其实在实验前老师已事先提醒学生不要进行“二次”点样，并详细介绍了可能产生“二次”点样的情况，但少数同学可能没在意或认为点样量“看起来太少”，于是又重复进行点样操作。

2.没出现电泳区带或不足五条区带

有的同学电泳实验结果没有出现区带或不足五条区带主要有下面一些原因。

2.1醋酸纤维薄膜在电泳仪两极放反了。电泳是带电粒子在电场中向电性相反的电极泳动的现象，根据实验原理，点样的一侧应离负极近，而有的同学正好放反，醋酸纤维薄膜放反会导致带电的粒子在薄膜上泳动的距离过短，蛋白质“跑到”滤纸上或电泳槽的缓冲液中去了，结果也就不会出现区带或不足五条区带。

2.2点样点反了。实验要求同学们先在醋酸纤维薄膜点样处划线，但有的同学划线不清楚，结果点样时也不知道具体的位置，事实上点样没有在划线处（在与之对应的离正极近的一侧），造成与上述2.1相同的结果，也不会出现区带。

2.3点样没点上去。点样时要求同学们用力不能太大也不能太小，太大会造成醋酸纤维薄膜折断，太小有可能样品根本没点到薄膜上或在薄膜上的样品太少，出现的结果不清晰，甚至没有区带。

2.4在光滑面点样。醋酸纤维薄膜有两面，一面有光泽，一面无光泽，无光泽面才是实验要求的点样面，操作时必须认真加以区别（有光泽的一面发生的是镜面反射，无光泽的一面发生的是漫反射，以此可以区别）。若点样错误地点在有光泽面上，带电的蛋白质就不可能在薄膜上移动，也就不可能有五条区带。

2.5电压太高或太低。电泳槽两极之间的膜长度为8cm—10cm，则需电压25V/cm膜长，电流强度为0.4mA/cm—0.5mA/cm膜宽。当电压过大或电流强度高，尤其在温度较高的环境中，可引起蛋白质变性或由于热效应引起醋酸纤维薄膜缓冲液中水分蒸发，使缓冲液浓度增加，造成膜片干涸，不可能出现电泳的结果（在预实验中我们曾以此为对照，确实不能出现区带）。电流过低，则样品泳动速度慢且易扩散，导致实验结果实验图谱不清晰或成片，达不到预期的效果。在实验中，当电泳的电压或电流达不到或超过上述值时，则应增加缓冲液浓度或进行稀释。缓冲液浓度过低，则区带泳动速度快，由于扩散变宽，区带中的蛋白质泳动到滤纸桥甚至到缓冲液中，不能形成五条区带；缓冲液浓度过高，则区带泳动速度慢，区带分布过于集中，形成一片，不易分辨出五条区带。

2.6点样用力不均匀或样品涂在玻片时不均匀。点样用力不均匀的结果是，样品有的点上去了，有的没有，这与取样涂在玻片不均匀相关。在血清中有的样品的量比较少，没点样上去导致不能形成区带。

2.7点样处放在电泳滤纸桥上。醋酸纤维薄膜上有样品的点样处不能放在滤纸桥上，薄膜放在滤纸桥上有一个平衡的过程，在此过程中，蛋白质的热运动可能造成样品在滤纸上扩散，而得不到五条区带。

2.8电泳的时间过短或过长。电泳时间过长，造成血清蛋白电泳区带“跑”到滤纸桥上或电泳槽的缓冲溶液介质中；电泳时间过短，造成血清蛋白电泳区带没有完全分离。在CAME实验时，电泳的时间以45—60min为宜，电泳的时间过短或过长，均得不到满意的结果。

2.9醋酸纤维薄膜的有光泽的一面向下。有光泽的面向下，导致实验电流不易通过，不能出现五条区带。

3.区带不均匀

3.1选择的醋酸纤维薄膜不合规定。市售醋酸纤维素薄膜均为干膜片，薄膜的浸润与选膜是否恰当也是电泳成败的重要步骤之一。将干膜片漂浮于缓冲液表面，其目的是选择膜片的厚薄及均匀度，若飘浮于液面的薄膜在15—30s内迅速润湿，整条薄膜色泽深浅一致，则此膜均匀可用于电泳。若膜片吸水不均匀，有白斑点或条纹，提示膜片厚薄不均匀，则应舍弃不用，以免造成电泳后区带不均匀或扭曲，区带与区带之间界线不清，背景脱色困难，结果重现性差。由于醋酸纤维薄膜亲水性比纸小，浸泡30min以上是保证膜片上有一定量的缓冲液，并使其恢复到原来多孔的网状结构。最好是让漂浮于缓冲液的薄膜吸满缓冲液后自然下沉，这样可将膜片上集聚的小气泡赶着走。点样时，应将膜片表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免缓冲液太多引起样品扩散。但也不能吸得太干，太干则样品不易进入薄膜的网孔内，而造成电泳起始点参差不齐，影响分离效果。吸水量以不干不湿为宜。为防止指纹对实验结果的影响，取醋酸纤维薄膜时，应用镊子或戴指套。

3.2铅笔划线时用力过大。铅笔划线时用力过大，可将膜条弄破或出现凹陷，而影响电泳区带分离的均一性。

3.3点样时用力过大、过小。点样时用力太大，将膜条弄破或出现凹凸不平，而影响电泳区带分离效果；点样时用力过小，玻片可能没有与膜片接触，导致点样量太少，则蛋白质量少，区带模糊不清。

3.4点样量不均匀。点样时，玻片片身必须与薄膜保持垂直，若不垂直，则既可能使点样量过少，又可能使薄膜折断或受损；在用玻片进行点样时，玻片上的样品涂得不均匀，有的地方多，有的地方少，会导致在醋酸纤维薄膜上的样品的量分布不均一，实验的结果也就显示图谱不均一。

当然，引起血清CAME图谱不理想的因素有很多，除上面介绍外，还有加样量、薄膜的致密性、醋酸纤维薄膜对蛋白质的吸附性、缓冲液的离子强度、电场中的电渗作用、实验温度的高低、薄膜放置是否与滤纸桥垂直、血清是否新鲜等诸多因素都可以影响实验结果。因此，在实验前，我们应对实验的条件进行考察，做好预实验；在实验中，要对学生进行认真的指导；在实验结束后，要组织学生讨论，对实验结果认真分析，保证学生实验顺利进行。

参考文献：

［1］乔明艳.细节决定生化试验的成败［J］.广西教育学院学报，2010,（1）：118-119.