基因工程中限制酶切割的几个问题

张玉林

限制酶全称限制性核酸内切酶，能识别并切割具有特异序列的双链DNA分子，主要从原核细胞中分离纯化而来，迄今为止，已分离出来的限制酶约有4 000余种。作为基因工程中非常重要的一种工具，它应用广泛，是历年高考中能力题的命题着力点，但由于书本相关内容介绍简单，而考试命题时常有所拓展，很多师生在解答此类题目时常发生认知冲突，产生很大的困惑，为此，笔者总结了教学过程中的一些问题，供大家参考。

1 限制酶能将外来的DNA切断，使之失去活力，对自己的DNA却无损害作用的原因

在人教版《生物·必修2·遗传与进化》中，关于“T2噬菌体侵染细菌”的实验就已经告诉我们，原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，这一点学生很容易理解并接受，但对于原核生物细胞内的限制酶只切割外源DNA，而不切割自身DNA，却难以理解。

在长期的进化过程中原核生物形成了一套完善的防御机制，以保持自身遗传的相对稳定性。当外源DNA侵入后，限制酶就将其切割掉，使外源DNA不能发挥遗传效应，但限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对存在，它们具有相同的底物专一性，具有识别相同碱基序列能力。甲基化酶的甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸，甲基受体为DNA上的腺嘌呤与胞嘧啶。当限制酶作用位点上的某一些碱基被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了，所以限制性内切酶只降解外源入侵的异种DNA，而不分解自身DNA，在消解外源DNA遗传干扰的同时又保护了自身遗传特性的稳定。

2 一种限制酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列吗

在人教版《生物·必修2·遗传与进化》P102中，明确指出：“一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子”，但真实情况却并非如此，有少数限制性核酸内切酶可以识别两种以上的核苷酸序列。如HindⅡ的识别序列为5′…GTPy↓PuAC…3′，其中Py=C或T；Pu=A或G。这样HindⅡ的识别序列实际为四种，如图1所示。

3 不同种类的限制酶识别的核苷酸序列一定不同吗，切割位点一定不同吗

有一些限制酶虽然来源不同，但识别的是同样的核苷酸序列，这类酶称为同裂酶，而同裂酶的切点位置可能相同，也可能不同，如图2和图3所示。

（1） 切点位置相同：

（2） 切点位置不相同：

4 如果不同种类的限制酶分别识别不同的核苷酸序列，是否一定产生不同的黏性末端

有些限制酶虽然来源各异，识别的靶序列也不相同，但切割双链DNA后却可以产生相同的黏性末端，这一类限制酶称为同尾酶，如图4所示。

值得注意的是，BamHⅠ和BglⅡ切割DNA后虽然产生了相同的黏性末端，但如果这样的黏性末端相结合，将不能再被BamHⅠ或BglⅡ识别并切割。

5 构建酶切图谱时，确定限制酶切点位置的方法

人们为了了解基因的结构，通常选取某一特定长度的DNA分子，用多种限制酶单独或联合切割，再通过电泳技术将酶切片段进行分离，计算相对大小，以确定每一种限制酶在DNA分子中的切点位置和相对距离，即构建酶切图谱，一般以直线或环状图式表示。酶切图谱的构建在DNA序列分析、基因文库的构建等工作中具有重要意义，那究竟如何构建酶切图谱呢？例如用限制酶EcoRV、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如图5所示。

质粒为环状双链DNA分子，一次切割只能产生一个片段，故EcoRV切点数目为1，MboⅠ切点数目为2。将单酶切片段与双酶切片段逐一比较，绘制酶切图谱。图5中MboⅠ切割后产生一个大片段11.5 kb与双酶切产生的5.5 kb和6 kb重叠，确定EcoRV的切点位置在11.5 kb中。因此给出的质粒及酶切位点如图6所示。