杜仲提取物对小鼠皮肤光老化保护作用的实验研究

李建民,刘琦,王雪,张宁,徐艳明,陈巧云

[摘要]目的：研究杜仲提取物对光老化模型小鼠皮肤的保护作用。方法：用紫外光疗仪（UVA+UVB，模拟日光）照射KM小鼠，建立光老化小鼠模型，灌胃或外用给予杜仲提取物，观察小鼠皮肤的组织形态，测定小鼠血浆中超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）的含量。结果：外用及灌胃低剂量杜仲提取物均能有效提高小鼠血浆中SOD活力（P＜0.05）、降低MDA含量（P＜0.05），且外用能显著减轻小鼠皮肤组织受损程度。结论：杜仲提取物具有抗皮肤光老化的作用，且外用优于口服，作用机制可能与其能够清除自由基和活性氧，从而防止组织过氧化损伤有关。

[关键词]杜仲；光老化；丙二醛；超氧化物歧化酶

[中图分类号]R332[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）03-0584-03

Experimental study on the protective effect of eucommia extract on the mice skin photoaging

LI Jian-min,LIU Qi,WANG-Xue,ZHANG Ning,XU Yan-ming,CHEN Qiao-yun

(School of Jiamusi,Heilongjiang University of Chinese Medicine,Jiamusi 154007, Heilongjiang,China)

Abstract:ObjectiveTo study the protective effects of Eucommia extract on the skin of photoaging-model mice.MethodsIrradiate KM mice with UV (UVA+UVB, simulate soler) machine to develop photoaging-model mice,Eucommia extract were given by Internal and external,then the histology of skin tissue was observed,the activities of superoxide dismutase (SOD) and the contents of malondialdehyde (MDA) were examined.ResultsEucommia extract could enhance the activities of SOD (P<0.05), decrease the contents of MDA in both Internal and external (P<0.05),histological observation showed that external could improve the damage degree of the skin of mice.ConclusionEucommia extract has the protective effect on the skin of photoaging-model mice,external is better than Internal,the mechanism may be related to eliminating free radicals and active oxygen,protecting the skin tissue from peroxide damage.

Key words:eucommia; photoaging; MDA; SOD

前期研究证明杜仲提取物对长波紫外线及中波紫外线致表皮角质形成细胞、真皮成纤维细胞光老化均有保护作用[1-3]，从细胞水平验证了杜仲提取物具有抗皮肤光老化的潜力。本实验选择KM小鼠为研究对象，建立小鼠光老化动物模型，采用灌胃和外用两种方式，通过HE染色制片观察皮肤组织形态学改变，试剂盒法测定小鼠血浆超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）含量，在整体动物实验水平进一步验证其抗皮肤光老化的作用，并初步探讨其机制。

1材料和仪器

1.1材料：清洁级KM小鼠48只，体重（20±2）g，雌性（黑龙江中医药大学动物中心提供），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2仪器：紫外光疗仪（Sigma公司），紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂），Rsearch UV UF型超纯水制备系统（上海和泰仪器有限公司），YB1201DW型电子天平（上海海康电子仪器厂），8-5K离心机（上海安亭科学仪器厂），半自动生化分析仪（四川美生科技有限公司），脱毛膏（薇婷）。

2实验方法

2.1药液的制备：口服药液的制备：将杜仲提取物[1]溶于蒸馏水中分别制成0.1g·ml-1和0.3g·ml-1的药液。外用药的制备：将16醇和十六烷基糖苷、单硬脂酸甘油酯、橄榄油、角鲨烷、十六-十八醇混合后升温至80℃溶解制得油相；将甘油加入去离子水中，升温至80℃，加入对羟基苯甲酸甲酯，搅拌至全部溶解，制得水相；然后，将水相加入油相中，均质8min，搅拌降温至40℃，加入用丙二醇分散的杜仲提取物，搅拌至分散均匀，制成含1.5%杜仲提取物的乳霜。

2.2小鼠光老化模型的建立：各组小鼠称重，做标记，全价饲料适应性喂养一周。除空白组外其余各组小鼠每天或每2天用脱毛膏将背部毛脱干净，面积2cm×2cm。将小鼠置于紫外光疗仪灯具下（UVA+UVB，模拟日光）照射，照射距离40cm。每天照射15min，连续照射20天，达到累计照射剂量UVA为20.6mJ·cm-2、UVB为1.8mJ·cm-2，造模完成。

2.3分组及给药：小鼠48只，随机分为6组，每组8只，分为空白组、蒸馏水灌胃组、高剂量灌胃组、低剂量灌胃组、外涂基质组、外涂药物组。空白组：正常饲养；蒸馏水灌胃组：造模，每天灌胃蒸馏水；高剂量灌胃组：造模，每天按3.2mg·g-1体重的剂量灌胃；低剂量灌胃组：造模，每天按0.8mg·g-1体重的剂量灌胃；外涂基质组：造模，每天涂乳霜基质0.1g；外涂药物组：造模，每天涂抹含杜仲提取物的乳霜0.1g。

2.4取材：第21天，用乙醚麻醉小鼠，置于手术台上，剃毛，常规手术取下实验暴露部位皮肤，浸入10%福尔马林中固定24h。摘眼球取血1ml，置于EDTA抗凝管中，3000r/min离心10min，取血浆。

2.5指标观测

2.5.1皮肤病理切片观察：将取下的组织块浸入10%甲醛固定。12h后，取出固定好的组织块进行蜡块包埋。蜡块切片后，将切片HE常规染色。

2.5.2小鼠血浆中SOD、MDA测定：取10μl小鼠血浆按SOD测定试剂盒说明进行检测，取100μl小鼠血浆按MDA测定试剂盒说明进行检测。

2.6统计处理：所有数据均通过SPSS18.0软件完成数据分析，计算资料以x±s表示，各组间均值比较采用方差分析，P＜0.05有统计学意义。

3实验结果

3.1灌胃给予杜仲提取物对光老化模型小鼠的影响

3.1.1皮肤一般形态：与空白组相比，蒸馏水灌胃组小鼠背侧表皮有早期轻度红斑形成，随着照射剂量的增加皮肤颜色加深、增厚、脱屑，严重者出现皱缩、粗糙变硬，失去弹性及光泽；与蒸馏水灌胃组相比，灌胃给药组小鼠无明显变化。

3.1.2皮肤组织形态学：见图1。空白组小鼠皮肤表皮层结构完整，细胞分层清晰，厚度正常，细胞成分及数量适中，真皮层可见波浪状纤维组织，排列有序，分布均匀，疏密有致。而蒸馏水灌胃组小鼠表皮层增厚并伴有角质层变厚，细胞分层不清；真皮层因纤维组织发生变性或破坏，纤维排列紊乱，分布不均，并有较多的炎性细胞浸润。与蒸馏水灌胃相比，高、低剂量灌胃组小鼠皮肤组织有部分改善，但仍可见表皮角质层增厚，真皮层纤维组织断裂、破碎，卷曲扭结。说明灌胃给予杜仲提取物能够减轻小鼠皮肤光老化的程度。

3.1.3小鼠血浆中SOD活力、MDA含量：结果见表1。与空白组相比，蒸馏水灌胃组小鼠血浆中SOD活力明显降低（P＜0.05），MDA含量明显升高（P＜0.05）。与蒸馏水灌胃组相比，高剂量灌胃组小鼠血浆中SOD活力无显著性差异、MDA含量明显降低（P＜0.05）；低剂量灌胃组小鼠血浆中SOD活力明显升高（P＜0.05）、MDA含量明显降低（P＜0.05）。

3.2 外用杜仲提取物对光老化模型小鼠的影响

3.2.1皮肤一般形态：与空白组相比，外涂基质组小鼠背侧表皮颜色加深、增厚、脱屑，严重者出现皱缩、粗糙变硬；与外涂基质组相比，外涂药物组小鼠背侧表皮仅有稍许皮肤增厚，无脱屑、颜色加深。

3.2.2皮肤组织形态学：见图2。空白组小鼠皮肤表皮层结构完整，细胞分层清晰，厚度正常，细胞成分及数量适中，真皮层可见波浪状纤维组织，排列有序，分布均匀，疏密有致。而外涂基质组大部分小鼠表皮层增厚并伴有角质层变厚，细胞分层不清。纤维排列紊乱，分布不均。与外涂基质组相比，外涂给药组小鼠皮肤组织受损程度明显减轻，较接近正常组织，表皮稍有增厚，真皮层可见较完整的纤维组织，少见断裂、破碎，未出现卷曲扭结。说明EE外用能有效地改善小鼠皮肤纤维组织的病变，延缓皮肤的光老化。

3.2.3 小鼠血浆中SOD活力、MDA含量：结果见表2。与空白组相比，外涂基质组小鼠血浆中SOD活力明显降低（P＜0.05），MDA含量明显升高（P＜0.05）；与外涂基质组相比，外涂药物组小鼠血浆中SOD活力明显升高（P＜0.05）、MDA含量显著降低（P＜0.01）。

4讨论

4.1 本实验采用的是复合光源（UVA+UVB）模拟日光，采用小剂量紫外线长时间照射小鼠皮肤的方法，最大程度地模拟皮肤自然光老化的病理过程。实验过程中，选择远距离照射，避免动物皮肤在短时间内被灼伤[3]，经摸索发现40cm为照射最佳距离。实验结果表明，低剂量灌胃组小鼠血浆中SOD活力明显升高（P＜0.05）、MDA含量明显降低（P＜0.05），疗效优于高剂量组，说明高浓度的杜仲提取物可能会有毒性作用，而低浓度的杜仲提取物药效较好。

4.2 本实验对照组与空白组的结果比较显示，灌胃或外涂蒸馏水组小鼠皮肤组织的SOD降低，MDA升高，SOD减少使组织抗氧化防御体系作用减弱，过量的MDA进一步与磷酸酰乙醇胺和蛋白质交联，生成无活性的大分子复合物即脂褐素[4]，加重机体皮肤光老化。灌胃或外用给予杜仲提取物后，HE切片结果显示，杜仲提取物减轻了皮肤松弛、红斑、多皱纹等皮肤光老化现象，改善皮肤外观状态；小鼠血浆中SOD活力明显升高、MDA含量明显降低，说明杜仲提取物起到了外源性的抗氧化剂作用并使机体内氧化还原体系重新恢复平衡。从灌胃组和外用组的结果看，外用杜仲提取物对小鼠血浆中SOD尤其是MDA含量的影响比灌胃效果好，且中药外用具有低免疫原性、低毒副作用和皮肤耐受的优点，故采用外用杜仲提取物比灌胃更简洁、方便、低毒、高效。

4.3 本实验结果显示，杜仲提取物对皮肤光老化有一定改善作用，其机制与杜仲提取物能清除自由基和活性氧，防止其造成组织过氧化损伤有关。通过此实验研究不仅为杜仲抗衰防皱功效型产品的研制提供理论依据。

[参考文献]

[1]李建民,徐艳明,陈巧,等.杜仲对UVA致HaCaT细胞光老化保护作用的实验研究[J].中国美容医学,2010,19(009):1316-1318.

[2]张宁,陈巧云,徐艳明,等.杜仲对紫外线诱导的人皮肤角质形成细胞光老化模型的影响[J].中医药信息,2010,27(1):31-33.

[3]徐艳明,张宁,井丽巍,等.杜仲对紫外线致ESF-1细胞光老化保护作用的研究[J].中国实验方剂学杂志,2011,17(7):120-123.

[4]郭鲁义,李春雨,张宁,等.实用光老化动物模型建立方法的探讨[J].中国美容医学,2008,17(2):235-237.

[收稿日期]2011-09-24 [修回日期]2011-12-26

编辑/张惠娟