十精丸对UVA致ESF-1细胞光老化保护作用的研究

陈丽娟,王加志,徐姣,齐永华,黄昕红

[摘要]目的：研究十精丸抗紫外线致ESF-1细胞光老化作用，并初步探讨其作用机制。方法：用40J/cm2的UVA照射人皮肤成纤维细胞建立光老化细胞模型，以不同浓度十精丸提取物处理光老化细胞，MTT法检测细胞活力，羟胺法检测细胞超氧化物歧化酶（SOD）活性，比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，TBA法检测丙二醛（MDA）含量。结果：UVA照射成纤维细胞后，细胞活力下降，SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高（P<0.01），十精丸水提液中（100μg/ml）、高（200μg/ml）剂量组能显著提高成纤维细胞细胞活力、SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量（P<0.05或P<0.01）。结论：十精丸水提液可抑制UVA引起的成纤维细胞活性下降，推测其机制为通过提高SOD活力、加速氧自由基的清除和减少氧自由基的产生，使细胞的脂质过氧化损伤程度降低有关。

[关键词]十精丸；UVA；ESF-1细胞；光老化

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）04-0582-03

Protective effect of Shijingwan on photoaging induced by Ultraviolet A in ESF-1 cell

CHEN Li-juan,WANG Jia-zhi,XU Jiao,QI Yong-hua,HUANG Xin-hong

(Department of Cosmetology,Jiamusi College, Heilongjiang University of Traditional ChineseMedicine,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China)

Abstract: ObjectiveTo study the protective effect of Shijingwan agains UV irradiation-induceddamage in ESF-1 cells and its mechanism.MethodsThe model of photoaging fibroblasts was established by irradiating of ultraviolet light(40J/cm2). The different concentration water-extract solution from Shijingwan were used for photoaging cell. The proliferation of human fibroblasts was detected by MTT, and superoxide dismutase(SOD) and glutathione peroxidase(GSH-Px) activity, malondialdehyde(MDA) content were assayed by hydroxylamine, colorimetric and TBA methods respectively.ResultsThe proliferation activity of fibroblasts descended with the UVA irradiation, the activities of SOD and GSH-Px decreased, when the content of MDA was ascensive(P<0.01). But under the intervention at middle concentration(100μg/ml) and high concentration(200μg/ml) of water-extract solution from Shijingwan,the above changes induced by UVA irradiation were inhibited(P<0.05 or P<0.01).ConclusionThe water-extract solution from Shijingwan might inhibit the proliferation decreasing which induced by UVA. And its mechanism is due to its abilities of increasing SOD，scavenging oxygen free radicals.

Keywords:Shijingwan; UVA; ESF-1cell; photoaging

皮肤长期暴露于紫外线（UV）下可导致结构及功能的改变，从而加速或导致皮肤老化的发生，这种因UV照射引起的老化被称为光老化。皮肤光老化不仅有损于人的美容，而且可能与皮肤癌的发生也有着病因学的联系[1]。随着当前生态环境的恶化，皮肤光老化现象愈来愈严重，严重影响着人们的身心健康。十精丸为补肾方药之一，出自明代《普济方·卷二百二十三·诸虚门·补虚驻颜色附论》，是中医美容保健、延年益寿之传统名方。但目前十精丸抗皮肤光老化的基础实验研究薄弱，严重限制了十精丸疗效的进一步发挥。笔者以体外培养人皮肤成纤维细胞ESF-1为研究对象，在体外成功建立ESF-1 UVA光老化模型，探讨十精丸水提液对UVA损伤ESF-1细胞的保护作用。

1材料和方法

1.1实验材料和仪器

1.1.1材料：皮肤成纤维细胞ESF-1（北京协和细胞中心），DMEM培养基（Gibco公司，批号：12800-058），胎牛血清（Billab公司，批号：20101030）、胰蛋白酶（Billab公司，批号：20100901）、双抗（Billab公司，批号：20101230），MTT（Sigma公司），超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA）试剂盒测定试剂盒（南京建成生物工程公司，批号为：20110107），中药菟丝子、肉苁蓉、柏子仁、白茯苓、山茱萸、熟地、桂心、菊花、蜀椒、枸杞（北京同仁堂制药集团哈尔滨分店，经鉴定为正品）。

1.1.2 仪器：紫外照射仪（Sigma公司），紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂），Resecarch UV UF型超纯水制备系统（上海和泰仪器有限公司），LDZX-4DSBI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂），IX-71-21PH型Olympus倒置显微镜（日本 Olympus株式会社），HF90型二氧化碳培养箱（上海智城分析仪器有限公司），酶标仪（上海热电仪器有限公司），MS-500A半自动生化分析仪(美生科技有限公司)，冷冻干燥仪（上海热电仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 药物的配置：按十精丸药物组成及药量(十味各等份，共100克)，加1000ml蒸馏水加热煮沸30min，5层纱布过滤，滤渣加1000ml水再提取两次，合并三次滤液，浓缩成浸膏，经冷冻干燥制成粉末，保存于4℃冰箱中备用。实验时取十精丸水提液冻干粉用DMEM培养液配成所需浓度，调pH值为7.0，0.22μm微孔滤膜过滤除菌。

1.2.2 成纤维细胞ESF-1的体外培养：皮肤成纤维细胞ESF-1在含有10%胎牛血清的DMEM，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。取对数生长期的细胞以0.25%胰酶和0.02%EDTA消化，调整其密度为105个/ml，定量接种于96孔板中备用。

1.2.3 细胞光老化模型的建立：根据文献[2]计算紫外线的照射剂量，照射剂量（J/cm2）=照射强度（W/cm2）×照射时间（s），照射强度通过紫外线辐照计测量来测量。

按照文献[3-5]方法，将处于对数生长期的细胞接种于96孔板，待细胞单层贴壁后（24h），弃培养液，每孔加入150μl PBS，分别使用40J/cm2的UVA照射，正常组用铝箔盖住。

1.2.4 实验分组：按照预实验结果，将处于对数生长期的细胞接种于96孔板，随机分为正常对照组、模型对照组、十精丸水提液低（50μg/ml）、中（100μg/ml）、高（200μg/ml）剂量组。接种24h后各组弃培养液，每孔加入150μl PBS，除正常对照组外，按照2.3的方式造模。照光后弃去PBS，药物组加入含药的DMEM培养基，对照组加入不含药DMEM培养基，继续培养。以上各组细胞每组设6个复孔。

1.2.5 MTT检测细胞活力：五组均进行以下操作：接种于96孔板中的细胞，在第48h向每孔加入20μl MTT（5mg/ml），继续培养，4h后弃上清，每孔加150μl DMSO溶解，室温，振荡10min，使结晶溶解，酶标仪检测各孔492nm处的光吸收（OD）值，然后按公式（1）计算细胞活力：

1.2.6 检测细胞培养液中SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量：严格按照检SOD、GSH-Px和MDA试剂盒说明书操作。

1.2.7 统计学方法：用SPSS13.0软件对结果进行统计分析，各组数据以x±s表示，多样本间的方差分析采用LSD法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 十精丸水提液对ESF-1细胞细胞活力的影响：见表1。由表1得，模型对照组与正常对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01），说明模型制作成功。十精丸水提液各剂量组OD值均高于模型对照组，且在此剂量范围内，随着浓度的增加呈升高的趋势。十精丸水提液中、高剂量组与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

2.2 十精丸水提液对ESF-1细胞SOD活性、GSH-Px活性和MDA含量的影响：见表2。由表2得，与正常对照组相比，模型对照组的SOD、GSH-Px活性降低，MDA含量升高，差异有统计学意义（P<0.01）。与模型对照组相比较，十精丸水提液各剂量组均能提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量；且十精丸水提液中、高剂量组与模型对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。

3讨论

3.1 日光中的紫外线（UV）是引起皮肤损伤的主要环境因素，它可增加皮肤组织中的氧自由基，引起氧化损伤，同时可引起局部和系统免疫抑制和细胞凋亡，造成DNA损伤诱发突变，导致皮肤炎症、晒伤、光老化及皮肤肿瘤[1]。辐射到地面的UV主要是UVA（320～400nm）和少量UVB(290～320nm)，以往研究多集中于中波紫外线对人皮肤的损伤，而对长波紫外线UVA(320～400nm)的研究较少。阳光紫外线中所含的UVA具有很强的穿透作用(大约1 mm)，可影响位于真皮层的成纤维细胞[6]，影响皮肤胶原合成，进而引起皮肤光老化。目前从天然植物和传统药物中开发防皮肤光老化药物已成为国内外研究热点[7]。

3.2 十精丸出自明代《普济方·卷二百二十三·诸虚门·补虚驻颜色附论》，由枸杞、熟地、桂心(肉桂)、菊花、山茱萸、菟丝子、肉苁蓉、蜀椒、柏子仁、白茯苓(茯苓)十味中药组成。是中医美容保健、延年益寿之传统名方。其功效为“温肾滋肾，益精填髓，养心益智、平肝明目；乌须发，悦容颜，久服能轻身延年”。从以往的理论和研究看[8]，该方具有抗皮肤光老化，缓解紫外线对皮肤细胞损伤的潜在功效。在此笔者对十精丸水提液对UVA诱导的人皮肤成纤维细胞损伤的保护作用进行了初步研究。

3.3实验结果表明，40J/cm2的UVA照射导致ESF-1细胞SOD和GSH-Px的活性显著下降， MDA含量明显升高，细胞活力下降，证实了UVA可降低人真皮组织细胞清除和防御ROS的能力并导致氧化损伤。十精丸水提液低剂量组（50μg/ml）保护ESF-1细胞免受UVA损伤的作用效果不明显；中（100μg/ml）、高剂量组（200μg/ml）均能显著提高SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量，增强细胞活力，有效地对抗UVA对成纤维细胞氧化性损伤。

综上，十精丸可明显保护人成纤维细胞ESF-1免于UVA损伤，其具体机制可能与抑制氧化损伤和增强细胞抗氧化能力有关。本研究结果为开发天然光防护剂提供了理论依据，丰富十精丸抗皮肤光老化的理论研究，为其临床应用奠定基础。

[参考文献]

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[5]李建民，徐艳明，陈巧云,等. 杜仲对UVA致HaCaT细胞光老化保护作用的实验研究[J].中国美容医学,2010, 19(9):1316-1318.

[6]宋琦如,王发选,杨瑾.枸杞多糖对长波紫外线辐射暴露的人皮肤成纤维细胞的影响[J]. 环境与健康杂志,2007,24(8):586-588.

[7]戚秀中,张田野,苏永华,等.具有抗紫外线皮肤损伤作用的常用中药[J]. 中国美容医学,2010, 19(1):1728-1729.

[8]陈丽娟,王兴炎,董兴中,等.十精丸延缓大鼠皮肤衰老作用的实验研究[J].中国美容医学,2008,17(10):1485-1487.

[收稿日期]2011-10-20[修回日期]2012-01-18

编辑/张惠娟