白细胞介素-6基因-572G/C与-634G/C多态位点系同一位点的分析

陈俊飞

摘 要 近来研究发现，运动可以诱导骨骼肌大量表达白细胞介素-6（IL-6），并在能量代谢过程中发挥着重要作用。IL-6基因多态性可影响其蛋白的表达和生物功能的发挥，因而IL-6基因多态性成为代谢性疾病的遗传筛查、运动员遗传选材等关注的焦点。有研究分别分析了-572C/G、-634C/G位点多态性，也有研究同时分析这两个位点的多态性，但其研究中显示等位基因、基因型分布频率极为相似，那么这两个位点是否是高度连锁的不同位点？还是这两个位点其实就是同一位点？本研究运用PCR-RFLP、基因测序及序列比对（BLAST），从不同角度对-572C/G、-634C/G位点是否是同一位点进行分析。

关键词 IL-6 基因多态性 -572C/G -634C/G 同一位点

中图分类号：R392.13 文献标识码：A

Interleukin-6 Gene Polymorphism of -572G/C and

-634G/C Point to the Same Site Analysis

CHEN Junfei

(Jiangsu Institute of Sports Science, Nanjing, Jiangsu 210033)

Abstract Recent study has found that exercise can induce large amounts of IL- -6 expression in skeletal muscle (IL-6), and played an important role in the energy metabolism processes. IL-6 gene polymorphism may affect its expression and biological function of proteins and IL-6 gene polymorphism of metabolic diseases of genetic screening, genetic selection of athletes and other focus of attention. Study analysis, respectively -572C/G, -634C/G locus polymorphism, there are research and analysis of polymorphism of both sites, but their research shows the allele, genotype frequency distribution very similar, this is a high point two chains of different sites? Are these two points is the same point? This study using PCR-RFLP, genes, sequencing and sequencealignments (BLAST), from a different perspective, and analysis on-572C/G and -634C/G point at the same point.

Key words IL-6; gene polymorphisms; -572C/G; -634C/G; at the same point

0 前言

众所周知，体育锻炼可以提高机体的免疫力，那么其究竟如何改善机体的免疫能力呢？研究者进行了运动与免疫方面的研究，结果显示IL-6对运动的反应是最明显的。进一步研究发现，运动能够诱导骨骼肌表达IL-6，并参与能量代谢，IL-6不仅可以增加骨骼肌对葡萄糖摄取和利用，而且能增加脂肪酸氧化。

在医学中，研究人员在密切关注IL-6与代谢性疾病的遗传、发生、发展的相关关系；与体育科学中，IL-6也被用于遗传选材的研究等。随着对IL-6越来越多的关注和研究的深入，关于IL-6基因多态性的文献也越来越丰富。其中，有研究分别分析了-572C/G、-634C/G位点多态性，也有研究同时分析这两个位点的多态性，但其研究中显示等位基因、基因型分布频率极为相似，那么这两个位点是否是高度连锁的不同位点？还是这两个位点其实就是同一位点？本研究试图运用多种方法系统、准确论证IL-6基因-572C/G、-634C/G位点是否是同一位点进行分析。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象

研究对象来自北京市城区某中学（12~15岁）142名学生，其中男生63人，女生79人，父母均为北方平原汉族。

1.2 研究方法

1.2.1 -634C/G、 -572C/G位点引物序列比对

分别对文献中所引用的-572C/G、-634C/G位点引物在UCSC上的(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?org=human) 进行BLAST，鉴别PCR产物是否是IL-6基因的扩增产物。

1.2.2聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法基因分型

所有受试者空腹抽取静脉血，采用胍盐酸法提取基因组DNA，PCR-RFLP法对多态位点等位基因进行基因型分型。 -572C/G、-634C/G引物分别采用文献中的引物，引物由北京赛百成盛有限公司合成。引物序列如下：

分别进行基因序列扩增，-634C/G 位点：PCR反应体系20 l，包括0.4 l基因组DNA，10譖CR Buffer 2 l，TaqDNA 聚合酶1U，2.5mmol/L dNTPs 0.6 l，10 M上下游引物各1 l，ddH2O 14.5 l。PCR反应循环参数：94℃预变性反应4min ；94℃变性 30s，58℃退火 30s，72 ℃延伸 30s，30 个循环；72℃延伸10min，4℃保存。-572C/G 位点：PCR反应体系20 l，包括0.3 l基因组DNA，10譖CR Buffer 2 l，TaqDNA 聚合酶1U， 2.5mmol/L dNTPs 0.6 l，10 M上下游引物各1 l，ddH2O 15.5 l。PCR反应循环参数：94℃预变性反应4min ；94℃变性 30s，57℃退火 30s，72 ℃延伸 30s，30 个循环；72℃延伸10min，4℃保存。

扩增产物均用MbiI限制性内切酶进行酶切，反应终产物进行跑胶，在紫外灯下判断多态位点基因型。IL-6 基因-634C/ G多态性，PCR 扩增产物片段大小为181 bp，根据限制性内切酶MbiI 酶切片段的情况，基因型有3 种，CC 型(181bp 1 条带)，CG型(181bp，121bp，60bp 3 条带)，GG型(121bp，60bp 2 条带)。IL-6 基因-572C/ G多态性，PCR 扩增产物片段大小为182 bp，根据限制性内切酶MbiI 酶切片段的情况，基因型有3 种，CC 型(182bp 1 条带)，CG型(182bp，122bp，60bp 3 条带)，GG型(122bp，60bp 2 条带)。

1.2.3 PCR产物基因测序

随机抽取不同基因型受试者的PCR产物6份（每种基因型2份），对rs1800796位点的部分PCR产物用ABI PRISM 3730XL测序仪进行序列测定，测序试剂为BigDye terminator v3.1。测序结果经Chromas软件对待检位点分析碱基类型。基因测序工作由上海生工生物工程有限公司(sangon)完成。

1.3 统计分析

统计学处理采用SPSS 11.5（SPSS software for Windows 11.5 package）统计软件包进行数据统计分析。多态位点的基因型分布情况进行Hardy-Weinberg平衡检验，检验样本是否来自同一群体。不同组间多态位点的分布频率的差异采用卡方检验。

2 研究结果

2.1 引物比对结果

在UCSC上 (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?org=human)分别对引物进行BLAST，结果显示产物是IL-6基因的扩增产物。

2.2 聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）法基因分型结果

图1 不同基因型PCR片段测序结果

IL-6基因-572C/G、-634C/G位点等位基因分布一致：C（197），G（101），且基因型分布频率一致：CC（66人），CG（67人），GG（14人），均符合Hardy-weinberg平衡检验（ 2 = 0.507，P = 0.476），样本均来源于同一群体。

2.3 PCR产物基因测序结果

PCR产物测序结果显示：同一受试者基因型一致，且两个产物序列一致。基因测序图如图1所示。

3 分析与讨论

3.1 引物比对结果分析

对文献[5]中IL-6基因 -634C/G位点和-572C/G位点引物BLAST结果显示产物是IL-6基因的扩增产物。这与引物引自IL-6基因多态研究文献是一致的。

3.2 等位基因分布及基因型分布频率分析

文献中对于这两个位点同时的分析，也是发现其等位基因分布、基因分布频率相似。本研究结果显示IL-6基因-572C/G、-634C/G位点等位基因分布一致：C（197），G（101），且基因型分布频率一致：CC（66人），CG（67人），GG（14人），均符合Hardy-weinberg平衡检验（ 2 = 0.507，P = 0.476），样本均来源于同一群体。因此，-572C/G与-634C/G位点极可能是高度连锁的两个多态位点，或者这两个位点其实是同一位点。故有必要对PCR产物的序列进行测序，研究两个位点是否在同一位置。

3.3 位点一致性分析

所有-634C/G位点的研究文献中所用的引物，均是引用前人，追其源头，实际上是来源于1999年发表的文献，而人类基因组草图于2001年初在《自然》和《科学》杂志上公布，公布时草图还有许多缺陷，一些定位并不准确，随后科学家后续的序列测定和检验，使基因图精度不断提高，达到99.9%以上。并且从最新的dpSNP数据库中IL-6基因并没有-634C/G SNP位点。

本研究对不同基因型PCR产物进行基因序列测定，并将产物序列在NCBI上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi ?taxid=9606)进行序列比对，结果显示两个产物序列一致，多态位点的位置相同，且同一受试者基因型一致，这两个多态位点是同一个位点，即rs1800796多态位点。

因而，在我们今后的研究和分析中，就可以把以前关于-634C/G位点和-572C/G位点的研究成果放在一起共同讨论。这将极大丰富、并综合以往关于IL-6基因多态性研究的成果。

3.4 位点表述的准确性分析

由于该位点位于IL-6基因转录起始点上游-572位，故-634C/G的描述并不准确，准确的表述是-572C/G。

4 结论

（1）文献中所述的IL-6基因-634C/G位点与大多文献所述的-572C/G位点是同一位点，即rs1800796。

（2）关于IL-6基因-634C/G位点和-572C/G位点研究文献中的研究结果可以放在一起共同讨论。

参考文献

[1] Pedersen BK, Toft AD. Effects of exercise on lymphocytes and cytokines. Br J Sports Med. 2000. 34(4): 246-51.

[2] Nielsen AR, Pedersen BK. The biological roles of exercise-induced cytokines: IL-6, IL-8, and IL-15. Appl Physiol Nutr Metab. 2007. 32(5): 833-9.

[3] 韦叶生,李壮,覃羽华.白细胞介素- 6 基因启动子多态性与血脂及血小板计数关系的研究.中国医师杂志,2005.7(5):583.

[4] Kim JG, Ku SY, Lim KS, et al. Cytokine production by whole blood cells: relationship to interleukin gene polymorphism and bone mass. J Korean Med Sci. 2005. 20(6): 1017-22.

[5] Jang Y, Kim OY, Hyun YJ, et al. Interleukin-6-572C>G polymorphism-association with inflammatory variables in Korean men with coronary artery disease. Transl Res. 2008. 151(3): 154-61.