纤维素酶高产菌株的选育

山西大学生命科学学院 王兴华

兰州交通大学化学与生物工程学院 孙 盈

纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中（Mandels，1976）。从自然界分离筛选新的纤维素酶高产菌株，可为生产高活性纤维素酶提供新菌种或酶基因（闫峰等，2009）。本试验从山西大学校园内采集各种树木和灌木丛下的土样，菌种经初筛和复筛及紫外诱变，以旨得到纤维素酶高产菌株。

1 材料与方法

1.1 原料及仪器

1.1.1 主要试剂 DNS试剂，羧甲基纤维素钠，新华定性滤纸，葡萄糖标准溶液，柠檬酸缓冲液。

1.1.2 主要仪器 721可见分光光度计 （上海佑科仪器仪表有限公司），电子天平JA1203N（上海精密科学仪器有限公司），手提式高压蒸气消毒器YXQSG46-280型（辽宁省丹东市日用五金厂），台式恒温箱振荡器THZ-82A型（上海跃进医疗器械有限公司），干燥箱101-2型（中华人民共和国上海实验仪器总厂），水浴锅（北京市长风仪器仪表公司），离心沉淀器80-2型（上海手术器械厂），显微镜（奥林巴斯）。

1.2 培养基

1.2.1 发酵培养基 羧甲基纤维素钠 （CMCNa）8 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白胨 2.5 g，酵母膏 0.5 g，水 1000 mL，调节 pH 7.0～7.2。

1.2.2 保存培养基（PDA培养基） 马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH自然。

1.2.3 刚果红-羧甲基纤维素琼脂培养基 （叶姜瑜，1997）。

1.3 菌种的筛选

1.3.1 土样采集 在山西大学校园内采集各种树木和灌木丛下，距土地表面5 cm处的混有枯枝及落叶的土样，共10份。

1.3.2 菌种的初筛 将不同稀释倍数的样品溶液涂布于1.2.3培养基上，30℃培养3～5 d，挑选HC（透明圈直径与菌落直径之比）大的菌落，保藏于PDA培养基斜面，以备复筛。

1.3.3 菌株的复筛 从PDA斜面培养基上挑取初筛菌种，按一定的接种比接入发酵培养基上进行发酵培养，30℃恒温培养4 d后测其纤维素酶活，重复3次取平均值。

1.4 测定方法

1.4.1 粗酶液的制备 将2 mL的无菌水分别倒入12株初筛得到的菌株斜面，之后无菌操作转入到装有40mL的CMCNa液体培养基中，于30℃，转速150 r/min的恒温摇床中培养4 d。液体发酵液在5000 r/min离心15 min，取上清液为粗酶液。

1.4.2 酶活测定方法

1.4.2.1 酶活的定义 CMC酶活单位定义为：在pH为7.0、温度为50℃条件下，每30 min水解CMCNa释放1 mg葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位，以U表示。滤纸酶活单位定义为：在pH为7.0、温度为50℃条件下，每1 h水解滤纸条释放1 mg葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位，以U表示。

1.4.2.2 葡萄糖标准曲线绘制 取6支洗净烘干的20 mL具塞刻度试管，编号后加入葡萄糖标准溶液 0、0.4、0.8、1.2、l.6、2.0 mL， 并依次加蒸馏水2.0、l.6、l.2、0.8、0.4、0 mL， 配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入1.5 mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5 min，取出冷却后用蒸馏水定容至20 mL，充分混匀。在520 nm波长下，以1号试管作为空白对照，调零点，测定其他各管溶液的吸光度值（A）并记录结果。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，以吸光度值（A）为纵坐标。

1.4.2.3 酶活力的测定 采用DNS法测定菌株的CMC酶活和滤纸酶活（钱存柔和黄仪秀，1999）。

1.5 紫外线诱变试验

1.5.1 孢子悬浮液的制备 挑取斜面培养基的一环菌，接入5 mL液体培养基中，放入培养箱中30℃培养24 h。然后在无菌条件下从中吸取125 μL菌液接入另一管5 mL液体培养基中，放入培养箱中培养24 h后从中吸取2 mL菌液至100 mL液体培养基中继续培养24 h。取出菌液后5000 r/min离心15 min，弃去上清液，用5 mL的无菌生理盐水洗涤菌体沉淀，倒入装有45 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，摇床20 min，振荡摇匀后将菌体稀释成108个/mL左右的孢子悬浮液，10 mL待用。

1.5.2 紫外线（UV）诱变 将上述配好的待用菌液10 mL于9 cm的平皿内，放入转子置于磁力搅拌器上，紫外灯（254 nm，30 W）位于培养皿上方 30 cm 处，设定不同的辐射时间（1、2、3、4 min）进行诱变。诱变处理后的菌悬液用无菌水进行梯度稀释，并涂平板，之后避光培养。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的测定结果 见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 初筛结果 本试验共筛选出30株能在刚果红-羧甲基纤维素琼脂培养基上产生透明圈的菌株，其中HC值＞1的有12株，编号从F1到F12，并对各个菌株的透明圈直径和菌落直径进行测量，结果见表1。由表1可知，F1的透明圈直径最大，菌株F4的菌落直径最大，菌株F8的HC值最大。

表1 透明圈和菌落的直径及其比值

2.3 复筛结果 为了进一步研究纤维素分解菌的酶特性，筛选出高酶活的菌株，对初筛的12株菌进行液体发酵4 d，并测定其CMC酶活，结果见表 2。由表 2 可知，F1、F2、F3、F5、F6、F8 具有较高的酶活，通过初筛结果可知，这6株菌在初筛试验中透明圈直径和菌落直径也有较大的比值。

表2 不同菌株酶活测定结果

2.4 菌株的紫外诱变试验结果

2.4.1 紫外诱变致死率 菌悬液在紫外灯辐射不同时间后，按不同稀释梯度涂布于刚果红-羧甲基纤维素培养基，30℃避光培养24 h，计算菌株死亡率。紫外辐射3 min，致死率达到90%；紫外辐射4 min，致死率达到99%以上。紫外辐射时间与致死率的关系见图2。

图2 紫外诱变致死率

2.4.2 菌株F6紫外诱变结果 在其他条件不变的情况下设定不同的时间梯度（1、2、3、4 min），其中1～3 min的诱变效果不理想，透明圈大小与酶活均不高，4 min的诱变效果较为突出。由表3可见，菌株4-2-2的滤纸酶活和CMC酶活最高，分别达到1827.372 U/mL和3171.598 U/mL；菌株4-2-3的 HC值（D/d）最大，但滤纸酶活和CMC酶活均不是最高；菌株4-2-7的CMC酶活与滤纸酶活比值最大，说明所产纤维素酶以内切酶为主要成分。

2.4.3 菌株4-2-2的镜检特征 通过光学显微镜观察发现，菌株4-2-2的孢子丝较直，有隔膜，有二叉分枝。菌丝成熟后断裂成单个或成链、长筒形、末端钝圆的节孢子。

2.4.4 菌落透明圈的比较 原始菌株F6的菌落直径及透明圈直径均小于突变株，其中菌株4-2-2的透明圈为最大，HC值也为最大值。结合2.4.2及2.4.4的结果，说明经4 min的紫外诱变处理后，得到一株能高产滤纸酶和CMC酶的菌株4-2-2。

2.4.5 突变株与原始菌株产酶活性能的比较 由图3可知，菌株4-2-2产滤纸酶和CMC酶的酶活均比出发菌株高很多，并且均在第4天酶活达到最高值。

2.4.6 变异株遗传稳定性试验 为了测定突变株产酶的稳定程度，将突变菌株4-2-2在PDA培养基上连续传代，并在发酵培养基中培养，测定酶活，结果见表4。由表4可知，各重复值之间差异均不显著，因此，该菌株具有较好的遗传稳定性。

图3 突变株与原始菌株发酵产酶活性比较

表4 传代次数对酶活的影响U/mL

3 结论

人工诱变选育高酶活的纤维素酶产生菌及优化其产酶条件是降低纤维素酶生成本的重要方法（Thomas，1992）。 张海生等（2004）研究报道，以原始菌株里氏木霉M277为出发菌株，采取紫外诱变，经初筛、复筛获得M277-7高产菌株。本研究从土样中分离筛选出12株产纤维素酶能力较强的菌株，经摇瓶发酵复筛，获得了产纤维素酶活较高且稳定的菌株F6。以该菌株为出发菌株用紫外灯（254 nm，30 W）对其进行物理诱变，并设置不同的诱变时间（1、2、3、4 min），获得纤维素酶高产菌株4-2-2。通过DNS法测定菌株4-2-2的酶活，其CMC酶活达3171.598 U/mL，滤纸酶活达1827.372 U/mL，分别比出发菌株提高3.58倍和8.67倍。本试验对菌种进行诱变时仅采用紫外线照射，对于利用复合诱变技术是否有更为理想的效果还有待于进一步研究。

[1]Mandels M.发酵法生产纤维素酶的某些问题和解决办法[J].应用微生物，1976，6：53 ～ 62.

[2]钱存柔，黄仪秀.微生物学实验教程[M].北京：北京大学出版社，1999.

[3]闫峰，徐凤花，顾金刚，等.木霉属真菌的生物降解及生物转化作用研究进展[J].微生物学杂志，2009，29（3）：77 ～ 80.

[4] 叶姜瑜.一种纤维素分解鉴别培养基[J].微生物学通报，1997，24（4）：251～252.

[5]张海生，陈德兆，黄利利，等.纺织用纤维素酶高产菌种的选育、固态发酵及其应用[J].印染助剂，2004，21（3）：39 ～ 40.

[6]Thomas M.Wood，Fungal cellulases[J].Biochemistry Society Transaction，1992，20：46 ～ 53.