长期高糖导致SH-SY5Y细胞内多巴胺储量减少

彭 磊，谢冰洁*

（北京理工大学，北京，100081）

前言

糖尿病(diabetes)是一种与胰岛素产生和作用异常相关、以高血糖症为主要特征的代谢性疾病。糖尿病对神经系统的影响是全身性的，可累及中枢神经系统、周围神经系统和自主神经系统[1][2]。帕金森病是一种与年龄有关的神经系统退行性疾病，病因迄今不明。其主要的病理变化是黑质致密部(DSN)的多巴胺(DA)能神经元选择性缺失及纹状体多巴胺含量明显减少，残留神经元胞浆中出现嗜酸性包涵体—Lewy小体[3]。导致帕金森病主要有遗传因素和环境因素，遗传因素不能完全解释其临床特征，而且临床上有80%以上的患者为散发性，病因不明。流行病学调查显示：喝井水、农村生活史和杀虫药、除草剂等工业化合物的暴露是诱发PD的潜在危险因素。据文献报道，临床上在50、60年代糖尿病患者患帕金森病的患病率为73%，70年代为50%，90年代时为30.5%，而正常人患帕金森病的患病率仅为1%。行病学调查显示：糖尿病患者比正常人得帕金森病的几率要高83%以上[4]。尤其早期糖尿病，在没有其他并发症的时候，其患帕金森的的几率是正常人的7倍[5]。糖尿病(diabetes)和帕金森症是两种世界性的，常见高发的慢性病，对人类的生命健康威胁极大。流行病学研究提示我们糖尿病这种代谢系统疾病可能作为散发性PD患者的一个重要原因。多巴胺是脑内正常的神经递质。多巴胺在由酪氨酸羟化酶合成后储存于突触囊泡，胞吐作用释放至突触间隙，部分通过DAT重摄取入胞质由VMAT2转运至囊泡，避免DA在胞质内的过氧化，维持DA的稳态和循环利用[6][7]。而在帕金森病的晚期,有一个特征就是黑质纹状体通路的多巴胺含量减少。所以本研究以SH-SY5Y神经母细胞瘤作为多巴胺能神经元的细胞模型，研究长期高葡萄糖的情况下,细胞内多巴胺的含量.

2 材料与方法

2.1 实验试剂与仪器

细胞培养基： Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM），美国 Gibco 公司；胎牛血清：美国 Gibco 公司；青霉素、硫酸链霉素、胰蛋白酶：北京拜尔迪公司；5-氟苯基色谱分离柱HS F5 column（5μm, 250 mm×4.6 mm）：美国Discovery®公司；库伦阵列高效液相色谱-电化学检测系统 CoulArray®Multi-Channel ECD system：美国 Esa公司；多巴胺标准品：美国 Sigma公司.

2.2 SH-SY5Y细胞培养

SH-SY5Y（人成神经细胞瘤细胞）由本实验室保藏。使用含 DMEM高糖培养基 90 %，胎牛血清10 %的培养液，于 37℃二氧化碳浓度 5 %湿度90%的二氧化碳培养箱中培养。

2.3 多巴胺及其代谢产物的检测

离心收集培养的细胞，按照3个大皿200μ 的比例将细胞重悬于含有蛋白酶抑制剂的PBS 溶液中。使用细胞超声破碎仪以 2s on，1s off的条件破碎 40秒，取10μL破碎液进行蛋白浓度测定，其余破碎液以 10：1的比例加入 0.1M 高氯酸除蛋白，样品于 4℃下以17,000 g离心20分钟，取上层清液，经0.22μm 水系滤膜过滤后作为色谱检测样品。利用HPLC-ECD 检测色谱条件：流动相 45mM 磷酸氢二钠、35mM 柠檬酸、0.13mM Na2EDTA、8% 乙腈 ， pH 值 4.0 ，流速 1mL/min 进样量 40μL 检测器电势 -50、50、300、350mV

2.4 数据统计

本研究中所有实验数据利用 Microsoft Office Excel 2007 进行数据统计。平行处理的样本进行平均值及标准误计算后做图，并以误差线的形式表示标准误。使用 SSPS 13.0软件进行t 检验（平均值的成对二样本分析）以分析显著性，*代表 P﹤0.05，**代表P﹤0.01。所有给出显著性分析的实验中，重复样本数 n均≥3。

3 实验结果

3.1 多巴胺含量的检测

本实验以SH-SY5Y神经母细胞瘤作为多巴胺能神经元的细胞模型,以200mmol/L葡萄糖处理SH-SY5Y模型细胞48小时，收集细胞,破碎细胞,用HPLC-ECD检测细胞内多巴胺的含量,结果如图一:

图1 细胞内多巴胺含量的检测绿线是对照组，蓝线是高糖处理组。红线为多巴胺标准品

图2 细胞内多巴胺含量统计图

从图2中可以看出：高糖处理下，SH-SY5Y细胞中多巴胺储量下降。多巴胺是脑内正常的神经递质,由酪氨酸羟化酶合成后储存于突触囊泡，胞吐作用释放至突触间隙，部分通过DAT重摄取入胞质维持DA的稳态和循环利用[6][7]。而在帕金森病的晚期,有一个特征就是黑质纹状体通路的多巴胺含量减少。长期高葡萄糖的情况下,细胞内多巴胺的含量减少,提示我们糖尿病患者有可能通过减少多巴胺能神经元中多巴胺含量增加患帕金森病的风险.

4 讨论

在帕金森病的病因调查当中,环境因素成为散发性PD的主要原因, 人在外界环境作用下，如：化学药物、环境污染、物理损伤、情绪压力等，会产生系列的应激反应，如：氧化应激。氧化应激能够导致LPO并产生一系列的小分子活性醛（如甲醛、乙醛、丙二醛、丙酮醛等），糖化反应（Glycation）或氨基酸氧化（amino acide oxidation）都是小分子活性醛可能的来源[8][9]。活性醛与DA作用能够在脑内生成CAIQs，合成过程可能包括合成酶催化和Pictet-Splender缩合反应两种途径[10][11]。它可以聚集在线粒体上抑制ComplexⅠ的活性，造成线粒体功能障碍，ATP合成降低和能量危机。最终导致多巴胺能神经元细胞死亡。

正常人患帕金森病的患病率仅为1%。行病学调查显示：糖尿病患者比正常人得帕金森病的几率要高83%以上[4]。尤其早期糖尿病，在没有其他并发症的时候，其患帕金森的几率是正常人的7倍[5]。我国糖尿病人群的构成以2 型糖尿病为主，占糖尿病人群的90% 以上。2 型糖尿病的病因非常复杂，涉及到各种遗传因素和环境因素以及它们间的相互作用。

研究发现 ：与正常个体相比 ,患者体内丙酮醛浓度明显增高.在药物进行治疗后，虽然血糖有所降低，但那是丙酮醛的含量无法回到基线[12]。

本研究证明高糖长期处理下SH-SY5Y细胞中多巴胺储量下降。糖尿病患者脑内丙酮醛浓度明显增高。黑质致密部和纹状体区的多巴胺能神经元区，由于神经递质多巴胺的含量很高，丙酮醛是多功能团羰基化合（DMCs）交联储存多巴胺的囊泡，使囊泡中的多巴胺游离出来，其又极易与含有氨基的多巴胺发生反应， 破环了多巴胺的稳态，使细胞内多巴胺的储量减少。

[1] 董石春.中医药治疗糖尿病周围神经病变近况[J].中医药信息,2005,22(4):22-23.

[2] 朱禧星.现代糖尿病学[M].上海医科大学出版社，2000.

[3] 王维治.神经病学[M].北京:人民卫生出版社，2006 :1095.

[4] Hu G, Jousilahti P, Bidel S.Type2 diabetes and the risk of Parkinson's disease.J.Diabetes Care.2007 Apr,30,4:842-7.

[5] JA Driver, A Smith, JE Buring.Prospective Cohrt Study of Type 2 Diabetes and the Risk of Parkinson’s Disease.J.Diabetes Care.2008,31: 2003-2005.

[6] Perez,R.G.etal.A role for alpha-synucleinin the regulation of Dopamine biosynthesis J.Neurosci.22,3090-3099

[7] Liu,D.etal.Silencing alpha-synuclein gene expression Enhance styrosinehy droxylase activity in MN9D cells.Neurochem.Res.33, 1401-1409

[8]Uchida K.Forum: Role of Oxidation in Atherosclerosis;Role of reactive aldehyde in cardiovascular disease.Free Radical Biol.Med., 2000, 28(12):1685-1696.

[9] Ellis E M., Reactive carbonyls and oxidative stress:Potential for therapeutic inter- venetion.Pharmacol.Therapeut., 2007,115: 13-24.

[10] Naoi M, Maruyama Y, Hashizume D, Nakahara T,Takahashi, Ota M.Dopamine-drived endogenous 1 (R),2(N)-dimethyl-6, 7-dihydroxy 1, 2, 3, 4-tetra-hydroisoquinoline, N-methyl-(R)-salsolinol, induced Parkinsonism in rats: biochemical, pathological and behavioral studies.Brain Res., 1996, 709:285-295.

[11] Robbins J H.Alkaloid formation by condensation of biogenic amines with acetaldehyde.Clin.Res., 1968,16:350.

[12] ZTurk1, INemet 2.Elevated level of methylglyoxal during diabetic ketoacidosis and its recovery phase.Diabetes Metab 2006;32:176-180