山西省灰霉菌对啶酰菌胺的敏感性测定

余玲，刘慧平，韩巨才，张宝俊

（山西农业大学 农学院，山西 太谷030801）

灰霉菌（Botrytis cinerea）具有繁殖快、遗传变异大和适合度高等特点，连续使用同一药剂极易产生抗药性［1］。目前，灰葡萄孢霉己对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类、N－苯氨基甲酸酯类、苯胺基嘧啶类和酰胺类杀菌剂产生了不同程度的抗性［1］。

啶酰菌胺是1992年德国巴斯夫公司研发的烟酰胺类杀菌剂［2］，杀菌谱较广，对白粉病、灰霉病、菌核病和各种腐烂病等非常有效，并且对其他药剂的抗性菌也有良好的防治效果，主要用于果树、蔬菜和大田作物等的病害的防治［3］。啶酰菌胺的靶标位点为病原菌线粒体呼吸电子传递链上的蛋白复合体Ⅱ，即琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）或琥珀酸－泛醌还原酶（succinate ubiquinone reductase，SQR），通过覆盖在辅酶 Q位点，阻断电子由铁硫中心［3Fe－4S］向辅酶Q的传递，从而干扰真菌的呼吸作用，阻碍其能量代谢，抑制病原菌的生长、导致其死亡［4，5］。

国外已经有啶酰菌胺田间抗性菌株的报道，产生抗性的真菌包括开心果赤星菌（Alternaria alternate）［6］，葡萄、草莓、苹果、蔬菜灰霉菌（Botrytis cinerea）［5］，黄 瓜 褐 斑 菌 （Corynespora cassiicola）［7，8］，西瓜蔓枯菌（Didymella bryoniae）［5］，葫芦白粉菌（Podosphaera xanthii）［5］。相关研究表明抗性菌株核基因中控制脱氢酶铁硫中心的组氨酸残基 发 生 了 突 变，且 大 多 是 单 基 因 突 变［5～10］。2007年，Stammler研究结果表明：灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）田间抗啶酰菌胺菌株是由于SdhB亚单位第225位和272位上的氨基酸突变所致，272位上的组氨酸残基突变为络氨酸或者精氨酸残基，225位脯氨酸突变为苯丙氨酸或亮氨酸；同年，巴斯夫公司也报道了Botrytis elliptica在SdhB亚单位位于272位上的氨基酸由组氨酸突变为酪氨酸或精氨酸而对啶酰菌胺产生抗性［3］。而啶酰菌胺在国内使用年限短，尚未出现田间抗性菌，关于其抗药性的研究报道也很少。根据所查文献，国内研究的主要是病原菌对该杀菌剂的敏感性。张传清［11］在2007做过灰葡萄孢对啶酰菌胺的敏感性研究，采用菌落直径法和孢子萌发法建立了灰霉菌对啶酰菌胺的敏感性基线1.07±0.11 mg·L－1、0.42±0.05mg·L－1。王建新［12］和刘新［13］也做过病原菌对啶酰菌胺的敏感性研究。本文主要参考张传清的研究方法测定灰霉菌的敏感性，并以张传清的敏感基线为基准，检测山西省灰霉菌敏感性是否下降。

1 材料与方法

1.1 菌株的采集

试验所用灰霉菌株部分由山西省农科院植保所提供，部分由笔者采集，见表1。通过单孢分离纯化得到139株灰霉菌株。

表1 供试灰霉菌株Table 1 Botrytis cinerea of the research

1.2 供试药剂

啶酰菌胺原粉（96.2%）由扬州昱峰化工有限公司提供。

1.3 方法

采用菌落直径法［11］测定灰霉菌对啶酰菌胺的敏感性。将啶酰菌胺原粉用丙酮溶解配成1g·L－1的母液，以0.2%的量加入乳化剂Tween 80备用，使用时将母液用无菌水分别稀释为121.5mg·L－1，40.5mg·L－1，13.5mg·L－1，4.5mg·L－1，1.5mg·L－15个浓度梯度，所配药液与PDA以1∶9的比例制成含药培养基，PDA中所含药剂浓度依次为12.15mg·L－1，4.05mg·L－1，1.35 mg·L－1，0.45mg·L－1，0.15mg·L－1。将已纯化的灰霉菌接种于PDA平板上，25℃培养5天，用直径5mm的打孔器在菌落边缘打取菌块，表面朝下接种于含药PDA平板上，以无药PDA为对照，每个处理重复3次。所有接上菌块的培养皿置于25℃的恒温培养箱，5天后用十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。所得抑制率数据采用DPS软件进行处理，求出毒力回归方程和EC50值（mg·L－1）。

2 结果与分析

晋中、太原等8个地区所有灰霉菌株EC50值及平均EC50值（mg·L－1）见表2。由表2可看出，所有灰霉菌株EC50值在0.22～11.67mg·L－1之间，地区之间菌株敏感性有差异，但大多数菌株EC50值小于5mg·L－1，个别菌株偏大。根据FAO推荐的抗药性划分标准［14］，参考张传清［11］的敏感基线（1.07±0.11mg·L－1），可以得出137株为相对敏感菌株，2株（长治、运城各1株）表现为低抗。敏感菌株占98%以上，由此说明山西省灰霉菌对啶酰菌胺的敏感性较高。

表2 山西省8个地区灰霉病菌对啶酰菌胺的敏感性Table 2 Sensitivity of Botrytis cinereafrom 8areas of Shanxi province to Boscalid

3 结论与讨论

研究结果表明，所采灰霉菌中137株为相对敏感菌株，2株表现为低抗（长治、运城各1株）。其中长治地区没有用药史，所测得的偏大的EC50值很可能由误差引起；而运城地区（新绛）有较短的用药史，但低抗菌株仅有一株，数量太少，无法计算抗性频率。由此可见山西省除了运城新绛县1株灰霉菌对啶酰菌胺敏感性下降，其他地区灰霉菌具有较高的敏感性。由于啶酰菌胺被FRAC归为中度抗性风险杀菌剂［4］，所以有必要对啶酰菌胺的抗药性进行监测。

张传清［11］的研究表明啶酰菌胺与苯并咪唑类，二甲酰亚胺类，嘧啶胺类杀菌剂无交互抗性，故可用于防治其他杀菌剂的抗性菌，从而使得该杀菌剂在山西省的使用将会越来越广，随之也将会带来一系列抗性问题。为了避免或延缓啶酰菌胺抗性的发生，可参照FRAC提出的使用建议：严格按照生产厂家推荐的使用方法及用量使用；与其他不同作用机制的药剂交替使用；尽量将该药剂与其他无交互抗性或负交互抗性药剂混合或混配来防治病害；作物每生长季节使用次数不超过3次，并且连续使用次数不超过2次；尽可能在发病前使用；对其田间抗性发展进行实时监测和及时治理［4］。

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