雷公藤乙素及其类似物对糖尿病肾病大鼠肾脏中转化生长因子β1的影响

臧立辉 王亚娟 曲有乐

浙江海洋学院，浙江 舟山 316000

雷公藤系卫矛科雷公藤属植物，其药用部位是该植物的根及茎［1，2］，其抗炎、免疫抑制等活性作用的主要成分是雷公藤二萜内酯类［3］。近年来雷公藤类药物广泛应用于糖尿病及其并发症的研究，而DN是糖尿病主要微血管并发症之一。研究显示，TGF－β1在DN的发生和发展过程中起到非常重要的作用［4］，其被认为是肾小球硬化和肾小管间质纤维化机制中最关键的细胞因子。另有证据表明，TGF－β1参与了DN的产生与发展［5］，并将血液中TGF－β1作为糖尿病肾病早期诊断敏感指标。本实验拟通过有效控制TGF－β1的含量，影响DN大鼠肾组织修复，探讨雷公藤乙素及其类似物对DN的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物

1.1.1 SD大鼠

清洁级雌雄SD大鼠60只，购于浙江省医学科学院，体重130g±10g，批号:0016453。

1.1.2 主要试剂

雷公藤甲素和雷公藤乙素 (上海雅吉生物科技有限公司，批号:07111G和YS0105，使用时用生理盐水配置成浓度为0.025mg/ml的溶液，4℃保存)。链脲佐菌素 (STZ美国Sigma公司产品，批号:31087，用前溶解在0.01 mol/L枸橼酸缓冲液中，pH值为4.5)。TGF－β1酶联免疫试剂盒 (北京博奥森生物技术有限公司，批号:201109)。

1.1.3 主要仪器

酶标仪 (美国伯乐型酶标仪HB.63－BIO－RAD680)，离心机 (LD5－2A台式低速离心机)，OLYMPUS光学显微镜 (SZ61体视显微镜)。

1.2 实验方法

1.2.1 DN大鼠模型的建立

普通饲料喂养四周后，按体重随即抽取12只大鼠作为空白实验组。其余48只按60mg/kg一次性腹腔注射3%STZ溶液，一周后尾静脉采血测定空腹血糖及尿量，将血糖≥16.7mmo1/L，尿量大于空白实验组的50%作为DN大鼠成模标准。

1.2.2 实验动物分组及给药

造模后的DN大鼠按体重随即分为四组，每组11只，分别为实验对照组、雷公藤乙素+雷公藤甲素联合治疗组、雷公藤乙素+缬沙坦联合治疗组、缬沙坦治疗组。DN大鼠按雷公藤乙素及其类似物200ug/kg.d、缬沙坦20mg/kg.d每日灌胃给药，连续给药12周。实验期间自由饮水，进食普通饲料。

1.2.3 动物处理方法及指标检测

连续给药12周后，一次性处死大鼠，同时解剖大鼠，收集肾脏标本。用常规病理切片HE染色法光镜下分析各组大鼠肾脏损伤的修复程度，用ELISA双抗夹心法检测大鼠肾组织和血清中TGF－β1的实际含量。

1.2.4 统计学方法

2 结果

2.1 实验中DN大鼠的一般情况

造模后，DN大鼠出现尿量明显增多，饮水量和饮食量明显增大的情况，体重明显降低，行为活动迟缓、毛色变暗、无光泽、体态消瘦等状况，给药六周后出现弓背、白内障等糖尿病并发症。

2.2 ELISA双抗夹心法检测结果

图1 ELISA双抗夹心法检测DN大鼠肾组织内TGF－β1标准曲线

治疗12周后处死大鼠并收集血清、肾脏标本。严格按照TGF－β1ELISA试剂盒实验说明操作步骤操作，绘制标准曲线 (R＞0.92)，见图1，并通过标准曲线计算DN大鼠肾脏和血清中的TGF－β1的含量。结果表明:空白实验组中大鼠肾组织TGF－β1的含量显著低于实验对照组 (P＜0.05)，且也明显低于雷公藤乙素+缬沙坦联合治疗组和缬沙坦治疗组 (P＜0.01)，而与雷公藤乙素+雷公藤甲素联合治疗组并无明显差异 (P＞0.05);实验对照组DN大鼠肾组织TGF－β1的含量显著低于雷公藤乙素+缬沙坦联合治疗组和缬沙坦治疗组 (P＜0.01)，而与雷公藤乙素+雷公藤甲素联合治疗组并无明显差异 (P＞0.05);雷公藤乙素+缬沙坦联合治疗组与缬沙坦治疗组之间DN大鼠肾组织TGF－β1的含量并无明显差异 (P＞0.05)，但均明显高于雷公藤乙素+雷公藤甲素联合治疗组 (P＜0.01)，见表1。

空白实验组大鼠血清中TGF－β1的含量明显高于造模各组 (P＜0.01);实验对照组DN大鼠血清中TGF－β1的含量明显低于各治疗组 (P＜0.01);雷公藤乙素+缬沙坦联合治疗组DN大鼠血清中TGF－β1的含量显著低于雷公藤乙素+雷公藤甲素联合治疗组 (P＜0.05)，明显高于缬沙坦治疗组 (P＜0.01);雷公藤乙素+雷公藤甲素联合治疗组DN大鼠血清中TGF－β1的含量明显高于缬沙坦治疗组 (P＜0.01)，见表1。

表1 ELISA双抗夹心法大鼠肾脏、血清中TGF－β1的实际浓度

2.3 HE 染色结果

2.3.1 造模成功组与实验对照组

肾脏皮质变薄，皮髓质界限不清，肾小球数目明显减少，残余肾小球不同程度纤维化，肾小管萎缩、纤维化，间质充血、出血，随着病程的进展大鼠出现持续蛋白尿、水肿和肾功能不全、尿毒症等症状，图2－A。

2.3.2 空白实验组

肾脏皮髓质界限清楚，肾小球和肾小管结构正常，间质轻度淤血 (处死大鼠时造成肾脏间质轻度淤血)，图2－B。

图2 各组大鼠肾脏病理HE染色图

2.3.3 雷公藤乙素+雷公藤甲素联合治疗组

肾脏皮质比治疗前明显增厚，肾小球结构基本正常，肾小管管腔完整，肾小管上皮细胞轻度水肿，间质无纤维组织增生，图2－C。

2.3.4 雷公藤乙素+缬沙坦联合治疗组

肾脏结构明显恢复，多数肾小球结构基本正常，肾小管上皮细胞轻度体积较大，部分肾小管上皮细胞呈现空泡变性，间质轻度充血，无明显纤维组织增生，图2－D。

2.3.5 缬沙坦治疗组

肾脏部分结构恢复明显，部分肾小球结构恢复正常，少数肾小球呈现不同程度纤维化，肾小管上皮细胞轻度水肿，部分管腔内见颗粒管型，间质轻度充血，有少量纤维组织增生，图2－E。

对比各组大鼠肾脏标本的病理切片，通过光镜观察显示实验结果表明:雷公藤乙素+雷公藤甲素联合治疗组肾脏结构恢复优于雷公藤乙素+缬沙坦联合治疗组和缬沙坦治疗组。

3 讨论

DN是糖尿病 (DM)严重的慢性并发症之一，也是DM患者重要的死亡原因。DM确切发病机制仍未完全阐明，既往的研究主要集中在血糖和血脂代谢紊乱等方面。本实验主要研究TGF－β1在DN的发生、发展中起着重要的影响及生物学作用。

研究表明［6］，中药对肾组织糖代谢紊乱、纠正脂代谢紊乱、改善微循环、调节细胞因子方面均有一定优势，经雷公藤乙素及其类似物治疗后，DN大鼠肾脏修复明显。有证据表明引起DN发生的原因不仅与糖基化终末产物对肾小球的毒性作用和血管紧张素Ⅱ等因素有关，而且与生长因子TGF－β等的作用有关［7］。在ELISA双抗夹心法检测到雷公藤乙素及其类似物治疗后DN大鼠肾组织中TGF－β1含量明显减少，是由于TGF－β1是一种调节细胞生长和分化的多肽，对肾小球细胞和细胞外基合成胶原蛋白，纤维连接蛋白、粘多糖、透明质酸等具有增多作用［8］。因此合理控制TGF－β1的含量，可以对肾组织起到有效的修复和保护作用;而雷公藤乙素和雷公藤甲素治疗组DN大鼠血清中TGF－β1含量明显高于其他各治疗组，是由于TGF－β1是由血管内皮生长因子 (VEGF)促进生成的血管内皮细胞和肾小球系膜细胞产生的，其作用还可诱导其表达，血清中TGF－β1的高含量更能对血管的生长和微血管通透性起到了修复和保护的作用。

综上所述，雷公藤乙素及其类似物能调节大鼠肾组织糖代谢紊乱，达到降低血糖和尿量的作用，并通过对TGF－β1的有效控制，对DN大鼠的肾脏的修复起到明显的作用，从而达到治愈DN的效果。

［1］苏维广，孟江.雷公藤的临床应用 ［J］.辽宁中医杂志，2003，30(10):845—846.

［2］许静亚，杨峻，李乐真，等.雷公藤抗肿瘤的实验研究［J］.中国中西医结合杂志，1992，12(3):161－164.

［3］Kupchan S M，Court W A，Dailey RG.et a1.Triptolide and tripdiolide.novel antileukenic diterpenoid triepoxids from Tripterygium willfordii［J］.JAm Chem Soc，1972，94:7194.

［4］Chiarelli F，Santilli F，Mohn A.Role of growth factors in the development of diabetic complications［J］.Horm Res，2000，53(2):53－67.

［5］Ziyadeh FN，Han DC，Cohen JA，et al.Glycated albumin stimulates fibronectin gene expression in glomerular mesangial cells:involvement of the transforming growth factor－β system ［J］.Kidney Int.1998，53(3):631－636.

［6］朱荣宽，李靖.中医药防治糖尿病肾病研究进展［J］.中国社区医师杂志，2011，30(13):199.

［7］李伟民，徐 魁，余亚娟，等.TGF－β1在糖尿病肾病中的含量检测［J］.咸宁学院学报 (医学版)，2004，18(1):30－32.

［8］Chen S，Hong SW，Iglesias－de la Cruz MC，et al.The key role of the transforming growth factor－beta system in the pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Renal Fail，2001，23:471.