传代神经干细胞体外分化研究

李淑芳 桑小军

包头医学院第一附属医院药剂科，内蒙古包头014010

神经干细胞是神经系统里面有自我增殖能力和多向分化潜能以及自我更新能力的多能干细胞，相关实验证实可分化为神经系统的细胞［1］。本实验从新生大鼠大脑匀浆分离培养神经干细胞，并且在普通血清内进行体外诱导分化，经证实为星形胶质细胞和神经元，为体内诱导神经元和神经胶质细胞的增殖修复神经组织探索新的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

干细胞常规培养基包含DMEM/F12和B27以及表皮细胞生长因子 (EGF)、碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF)。nestin抗体，NSE，GFAP通用型免疫组化试剂盒，以上材料来源于武汉博士德生物工程有限公司。新生1日龄Wistar大鼠30只，包头医学院动物中心提供。

1.2 细胞培养

无菌处死新生大鼠去大脑，加入胰酶和EDTA各1ml，恒温37℃消化时间8min，使组织细胞分离，并且吸管轻轻吹打充分分离细胞，以便于计数，计数完毕后后稀释至以1X105/ml接种细胞培养瓶内，常规DMEM/F12和B27以及表皮细胞生长因子 (EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)培养。每6天传代1次，根据显微镜下计数绘图形成生长曲线。

1.3 细胞免疫学鉴定

对连续培养的神经干细胞和分化细胞进行细胞免疫学检测。神经干细胞检测指标为nestin检测，取出细胞爬片放到35 mm细胞培养皿里，PBS洗3次。4%冷的多聚甲醛固定20min，PBS洗3次。然后0.2%Triton X－100通透10 min，PBS洗3次。接着与二抗相同宿主的血清封闭30min，PBS洗3次。一抗4摄氏度湿盒内过夜，PBS洗3次。二抗室温2h避光，PBS洗3次。最后蒸馏水洗掉PBS，甘油封片。荧光显微镜下观察，巢蛋白在细胞质表达，呈现红色荧光。GFAP在细胞质和表面突起呈现棕黄色。NSE在分化细胞胞质中呈现棕黄色。

2 实验结果

培养18h通过相差显微镜观察到部分细胞增殖分裂为细胞团块，细胞团块和数目随时间而增加。在第24 h观察到神经干细胞聚集，48～72h形成球形团块，形态规则，突起不明显。第8d可见数百细胞克隆团块呈现悬浮集落，部分细胞紧贴培养瓶内壁，第4周时细胞克隆呈大小一致的大球形和小桑椹状细胞克隆。细胞计数显示传代至第7代细胞数量平均增加67倍 (表1)。培养细胞细胞免疫荧光检查细胞质内表达巢蛋白nestin，继续培养反复传代后仍然持续表达 (图1)。10%胎牛血清诱导神经干细胞分化细胞进行HE染色，镜下可见分化细胞多突起。免疫学显示以NSE和GFAP阳性细胞为主 (图2)。

表1 培养细胞计数

图1 传代细胞中巢蛋白表达

图2 分化细胞免疫学显示NSE

3 讨论

神经干细胞处于未分化状态，在一定条件下分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等神经系统细胞，神经干细胞的特殊标志物包括巢蛋白 (nestin)和波形蛋白，以及RCl抗原等。巢蛋白在神经板上皮细胞即开始表达，当神经细胞的迁移基本完成后巢蛋白的表达量开始下降，并随神经细胞分化的完成而停止表达。巢蛋白被广泛用于神经干细胞的鉴定。［2，3］神经元的标志蛋白NSE是神经元特异性烯醇化酶，是神经元特异性蛋白。GFAP胶质纤维酸性蛋白是存在与星形胶质细胞中的特性标志蛋白。两种蛋白在分化细胞中的表达证实了所培养细胞克隆可以分化为神经元和星形胶质细胞。上述实验结果证实了所培养的神经细胞克隆具有自我更新能力和多向分化潜能，具备神经干细胞生物学属性。

相关实验证实一定浓度的EGF对神经前体细胞的增殖具有调节作用，可以促进增殖［4］。本实验所培养的细胞形态学观察呈圆形或者椭圆形，体积较小，核质比大，经过HE染色镜下课件对称性核分裂像，细胞克隆可传代7代以上。分化细胞为神经元和星形胶质细胞。在此基础下一步拟进行神经元损伤的体内诱导分化和功能修复的研究。

［1］Ernst C，Christie BR.The putative neural stem cell marker，nestin，is expressed in heterogeneous cell types in the adult rat neocortex［J］.Neuroscience，2006，138(1):183－188.

［2］Sung CS，Wen ZH，Chang WK，et al.Inhibition of p38 mitogen－activated protein kinase attenuates interleukin－1［beta］－induced thermal hyperalgesia and inducible nitric oxide synthase expression in the spinal cord［J］.Neurochemistry，2005，94(3):742 －752.

［3］Claire Boissart，Xavier Nissan，Karine Giraud － Triboult，Marc Peschanski，and Alexandra Benchouaetal，miR － 125 potentiates early neural specification of human embryonic stem cells.Development and stem cells［J］.2012，139:1247－1257.

［4］Jing Zhou，Gayatri Shrikhande，Jing Xu，Renée M.McKay，Dennis K.Burns，Jane E.Johnson，and Luis F.Parada Tsc1 mutant neural stem/progenitor cells exhibit migration deficits and give rise to subependymal lesions in the lateral ventricle［J］.Research Communications，2011，25:1595 － 1600.