人端粒酶逆转录酶基因转染人髓核细胞的安全性研究

吴剑宏，阮狄克，王德利，张 超，何 勍，王超锋，张 燕，辛洪奎，顾 韬，徐 成，刘 玥

近年来，基因治疗成为椎间盘退变性疾病生物学治疗的研究热点。随着对端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因研究的深入，通过载体将TERT基因转入细胞，进而激活细胞端粒酶活性，使细胞延长寿命，甚至使细胞“永生化”成为可能［1-2］。腺相关病毒是目前在基因治疗研究领域常使用的一种病毒类载体［3］，本研究使用腺相关病毒为载体介导人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)基因转染人椎间盘髓核细胞，评估重组腺相关病毒人端粒酶逆转录酶基因(recombinant adeno-associated virus vector-mediated hTERT gene，rAAV-hTERT)是否能转染体外培养人髓核细胞，并对其安全性相关指标进行检测，为进一步的功能研究及在体研究提供安全性证据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

DMEM培养液、PBS液(Hyclone)、胎牛血清(fetal bovineserum，FBS)(Gibco)，0.25%Trypsin-EDTA(Gibco)，trizol液(Invitrogen)，Ⅱ型胶原酶(碧云天)，鼠抗人hTERT蛋白单抗及羊抗兔/鼠二抗(Abcam)。PCR、RT-PCR 试剂盒(Promega)，75 μm的细胞滤膜(Millipore)，6孔培养板(corning)，PCR引物根据PCR引物设计原则，按照hTERT及甘油醛-3-磷酸 脱 氢 酶 (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)基因序列，利用 Prime Premer 5软件设计，由北京博迈德生物公司合成。3～4周龄裸鼠由北京大学医学部动物中心提供。rAAV-hTERT(病毒滴度=1×1012μg/mL)由北京五加和生物技术公司包装。Hela细胞由解放军307医院妇产科实验室惠赠。

1.2 方法

1.2.1 人椎间盘髓核细胞的分离与培养

椎间盘髓核标本来源于1名19岁男性的正常椎间盘髓核组织，将标本用PBS清洗2次后仔细分离出髓核组织，将髓核组织修剪成1 mm3大小的组织块，0.025% Ⅱ型胶原酶置于 37°C、5%CO2的细胞培养箱中消化14～16 h，将消化液用75 μm的细胞滤膜过滤，收集细胞以1×105/孔的密度培养于6孔培养板，以含10%FBS的DMEM为培养液，置于37°C含5%CO2的细胞培养箱中，2～3 d换液1次，于倒置显微镜下观察细胞生长状态。

1.2.2 rAAV-hTERT转染体外培养人髓核细胞

转染培养传代后的第2代人髓核细胞(70%～80%融合时)，计数细胞，用PBS清洗细胞2次，按推荐的感染复数(multiplicity of infection，MOI)每细胞105v.g 加入病毒转染液 2 mL，置于 37°C、5%CO2细胞培养箱中培养2 h，弃去病毒转染液，无血清DMEM培养基清洗2次，加入含10%FBS的DMEM培养基，培养传代，于不同的时间点取出部分细胞进行检测。实验共分3组:①rAAV-hTERT转染组;②AAV空病毒转染组;③未转染组。

1.2.3 rAAV-hTERT转染后转录水平的检测(RTPCR)

用半定量的反转录聚合酶链反应的方法来检测hTERT基因及GAPDH基因(内参照)在mRNA水平上的表达情况，在转染后的7 d、90 d、120 d、150 d各取6孔rAAV-hTERT转染组、AAV空病毒转染组及未转染组髓核细胞，将各组细胞各自混匀后用trizol法提取各组 RNA，然后利用 AMV random dT primer和AMV在42°C条件下孵育1 h，将 RNA反转录成 cDNA，以cDNA为模板在 PCR仪上进行PCR反应，PCR反应条件如下:95°C、5 min，94℃、45 s，56℃、45 s，72℃、45 s，33 个循环;72℃10 min。GAPDH上游引物:5’-GAA GGT CGG AGT CAA CGG-3’;GAPDH下游引物:5’-GGA AGA TGG TGA TGG GAT T-3’;hTERT基因上游引物:5’-GCC AGC ATC ATC AAA CCC-3’;hTERT基因下游引物:5’-CCA CGA ACT GTC GCA TGT AC-3’，PCR 产物以2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.4 rAAV-HTERT转染后蛋白水平表达的检测(western-blot)

在转染后的 7 d、90 d、120 d、150 d 各取 6 孔rAAV-hTERT转染组、AAV空病毒转染组及未转染组髓核细胞，以冷PBS洗涤3次后加入预冷的细胞裂 解 液 (1% NP-40，20 mmol/L Tris pH 7.4，150 mmol/L NaCl，10% 甘油，1 mmol/L苯甲基磺酰氟，10 mL抑菌肽，1 g/mL亮肽素，500 mmol/L正矾酸钠)，混匀，置于冰上 30 min，4℃、12000 ×g离心20 min，收集上清，BioRad法蛋白定量后调整蛋白浓度一致。加等量的2×SDS上样缓冲液，94℃变性10 min，配制150 L的聚丙烯酰胺分离胶，每孔上样60 g蛋白，电泳分离蛋白后，转移至硝酸纤维素膜，5%的脱脂牛奶封闭1 h后各样品用8%SDS-PAGE电泳分离，之后转移到硝酸纤维素膜。转移好的硝酸纤维素膜用5%脱脂奶粉+TBS 37℃封闭1 h，鼠抗人hTERT蛋白单抗(1∶1000，Abcam)4℃ 孵育过夜，TBS/0.1%Tween-20洗涤3次后加人辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠(1∶2000，Abcam)，37℃ 孵育1 h，TBS/0.1%Tween-20洗膜后用增强化学发光法检测目的条带的表达。图像扫描进行Western blot免疫印迹分析。另配置120 g/L的分离胶，按传统方法做内参GAPDH的Western blot免疫印迹。

1.2.5 髓核细胞染色体核型分析

取rAAV-hTERT转染组培养10代(120 d)细胞和未转染组2代髓核细胞培养于60 mL培养瓶中，以含10%FBS的DMEM为培养液，置于37°C、5%CO2细胞培养箱中，隔日换液，待细胞长满培养瓶底90% ～100%时，加入秋水仙素，终浓度为0.4 mg/mL，继续培养2 h后常规收获、制片，G显带后进行核型分析并显微照相。

1.2.6 髓核细胞裸鼠致瘤性分析

取3组体外传代7 d的髓核细胞及Hela细胞消化、离心，将细胞浓度调为3×107/mL，各取100 μL细胞悬腋注入5周龄裸鼠腋下，接种完毕后，置恒温、恒湿的无菌净化屏障系统饲养，接种后3个月处死裸鼠，记录肿瘤生长情况。

1.3 统计学处理

所有测量数据均用SPSS 13.0统计软件分析，对灰度值变化比较采用单因素方差分析，对染色体异常比率行卡方检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态学观察

各组细胞在单层培养条件下共培养14代(＞150 d)，倒置显微镜观察显示病毒转染后细胞形态较未转染细胞无明显差异，各组细胞在5代以前形态以多角形及长梭形为主，随着传代次数的增加，长梭形细胞比例逐渐增加，至培养14代(150 d)时，细胞形态呈现为一致的长梭形。

2.2 hTERT基因mRNA及蛋白表达检测结果

RT-PCR(见图1a)及Western-blot(见图1b)检测结果显示了一致性:3组细胞均检测到内参条带(GAPDH，220bp)，rAAV-hTERT转染组在转染后的7 d，90 d，120 d均可检测到hTERT基因的表达，在转染后150d未能检测到hTERT基因表达;另外2组则始终未检测到hTERT基因的表达。通过对PCR及Western-blot条带灰度值的比较分析(见图1c)，转染后第7天hTERT基因mRNA表达的相对水平是最高的，而随着细胞传代次数及时间的增加，hTERT基因mRNA表达的相对水平逐渐降低。

图1 hTERT基因的表达Fig.1 The levels of mRNA and protein expression for hTERT

2.3 髓核细胞染色体核型分析结果

体外培养2代(14 d)未转染组中期髓核细胞分裂数为50个，10代(120 d)转染rAAV-hTERT组中期髓核细胞分裂数为75个(见表1)，结果显示细胞为男性染色体核型，染色体总数为46条，可见部分染色体丢失(亚二倍体)，G-带核型分析未见染色体结构异常克隆，基本核型为男性正常核型(46，XY;见图2)。

2.4 裸鼠致瘤性结果

细胞接种1周左右形成肉眼可见肿瘤，3个月后3组细胞均未观察到裸鼠腋下肿瘤生长，而Hela细胞接种组可见明显的肿瘤形成，大小约3 cm×2 cm×2 cm(见图3)。

表1 髓核细胞染色体核型分析结果Tab.1 The results of the karyotypic analysis

图2 髓核细胞染色体核型分析代表图Fig.2 Karyotype analysis of rAAV-hTERT transfected HNP cells

图3 裸鼠致瘤性结果图Fig.3 The results of the oncogenicity in nude mice

3 讨 论

椎间盘的退变是受年龄、机械物理、细胞、基因以及生化因子等多种因素影响的复杂的病理生理改变［4-5］。目前的各种手术及非手术治疗手段仅仅是针对椎间盘退变引起的各种临床症状的治疗，而不是从恢复椎间盘细胞功能的角度上去逆转椎间盘的退变。生物学治疗由于具有延缓甚至逆转椎间盘退变的潜能，而成为近年来的研究热点［6］。在生物学治疗策略中，种子细胞的选择是一个非常关键的问题。近年来，在椎间盘退变性疾病种子细胞选择的研究上有很多进展［7-8］，可供选择的种子细胞也很多，如脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞及软骨细胞等，虽然均能达到生物学治疗的部分目的，但也存在着一些缺点和不足:①干细胞诱导分化的条件难以稳定掌握;②诱导分化的类髓核细胞的功能稳定性难以长期维持;③软骨细胞分泌的细胞外基质成分与髓核组织在量上有着明显的区别［9］。因而，尽管这些细胞都能在某种程度上部分恢复髓核的细胞外基质含量，但其毕竟不是真正意义上的髓核细胞。

因而，研究者又回过头来继续对髓核组织来源细胞加以研究，期望通过挖掘髓核细胞本身的未知潜能，使其作为生物学治疗的种子细胞来源。理论上，自体组织来源的细胞是最佳的种子细胞，然而髓核细胞来源有限，在长期的体外培养过程中容易发生细胞的去分化现象。随着对人类端粒酶基因的研究深入，通过将hTERT基因功能片段转入成体细胞，从而激活细胞端粒酶活性，进而维持端粒长度以帮助细胞逃过衰老过程，成为延长细胞寿命的一种良好方法。迄今为止，学者们已经利用hTERT基因在19种不同组织的35种细胞上进行了验证，证实hTERT基因能够延长细胞的生命，维持细胞的功能［10］。这一转基因策略同样也为延长体外培养髓核细胞寿命提供了可能。一个高效的基因治疗载体是基因治疗成功的关键，AAV是目前在基因治疗领域应用非常广泛的一个病毒类载体，AAV拥有较多的优势:①低致病性，低免疫原性，安全性好，迄今为止尚未在人类和哺乳动物身上发现和AAV相关的疾病［11-12］;②表达时间长;③转染效率较高，能转染分裂期和非分裂期细胞［13-14］。

对于椎间盘退变这种慢性疾病来说，需要转基因能在髓核细胞内获得一个长期、安全、高效的表达，这也是选择AAV作为基因治疗载体的主要原因。然而，在验证rAAV-hTERT基因转染髓核细胞是否有应用价值之前，尚需进行2步关键性的基础工作:①必须在体外实验中证实髓核组织对目的基因转染是易感的;②hTERT基因转染髓核细胞是安全的。本实验通过AAV载体将hTERT基因导入体外培养人椎间盘髓核细胞，并证实导入的hTERT基因能在髓核细胞内正确的表达，持续表达时间 ＞120 d。

正常人的体细胞染色体数目为46条，并有一定的形态和结构。染色体在形态结构或数量上的异常被称为染色体异常。染色体核型分析是细胞遗传学研究的基本方法，是研究物种演化、分类以及染色体结构、形态与功能之间的关系所不可缺少的重要手段。经核型分析后，可根据染色体结构和数目的变异来判断生物的病因，比如是由于缺少了什么样的基因才导致的这种疾病［15］。本实验结果显示rAAV-hTERT转染后10代髓核细胞与未转染2代髓核细胞均有一定比例的染色体结构异常，但2组细胞异常率差异并无统计学意义(P＜0.05)，未出现多倍体及染色体异常结构的克隆;由于并非固定部位的克隆，所以染色体数目的减少更可能是实验操作的原因，而非异常结构克隆，显示在遗传水平细胞未发生突变，不具致瘤性。

裸鼠体内致瘤性也是检验细胞致瘤性的一项标准技术［16］，裸鼠为人工去胸腺培育动物，其自身排斥反应较小，目前已广泛应用于肿瘤学研究中。本研究所选用的Hela细胞为宫颈癌细胞［17-19］，较之于其他来源肿瘤细胞，其特点为增殖异常迅速，从1951年发现至今，已培养了50多年，号称“不死”细胞，目前已广泛应用于肿瘤学相关疾病的研究中。本研究选择Hela细胞为阳性对照组，对其进行裸鼠体内移植研究，结果发现，Hela细胞在实验裸鼠中种植后1周左右形成肉眼可见肿瘤，而另外3组细胞在移植3个月后均未观察到裸鼠腋下肿瘤生长，提示rAAV-hTERT转染髓核细胞在有限的体外培养时间内不具有致瘤性，但其更长期的致瘤性还有待于进一步的观察研究。

本实验研究结果显示通过体外构建的rAAV-hTERT能成功转染体外培养人髓核细胞并正确表达，通过对体外培养细胞的染色体核型分析及裸鼠成瘤实验显示，rAAV-hTERT转染髓核细胞体外长期培养后未出现基因水平的突变，不具有裸鼠致瘤性，证实在体外培养一定时间内rAAV-hTERT转染髓核细胞是安全的，为进一步的rAAV-hTERT转染髓核细胞的功能研究及体内实验提供了安全性证据。

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