生物芯片在食品安全检测中的应用研究

孟 甜

（四川烹饪高等专科学校，四川 成都610100）

毒猪油事件、苏丹红事件、禽流感事件等食品安全事件的发生，直接危害了人民群众的健康安全[1]。目前的食品问题,已不再是以往供应量的问题,而是食品质量问题,食品质量安全问题构成了社会反映强烈的热点，成为还未解决的全球性难题[2]。食品安全检测技术是减少食源性疾病的基础，传统的检测技术虽能检测出有害的不安全因素，但存在操作繁琐、检测周期长、灵敏度低等缺点。如何快速准确的检测食品中有害成分、确保食品安全成为食品安全检测问题的重中之重[3]。

1 概述

1991年，美国的Affymetrix公司生产出世界上第一块基因芯片——寡核苷酸基因芯片。1995年，Standford大学应用DNA芯片技术成功检测了酵母菌的绝大部分eDNA或基因的表达，并完成了1046个人类基因的检测。1996年，世界上第一块商业化DNA芯片的问世，标志着基因芯片技术进入广泛研究和应用阶段[4]。它综合了分子生物技术、微加工技术、免疫学、计算机等多项技术，使生命科学研究中不连续的分析过程，集成在芯片上完成，实现样品检测分析过程连续化、集成化、微型化和信息化，生物芯片技术作为一代生物技术，在食品领域中具有广阔的基础研究价值和产业化前景[5]。

1.1 原理

生物芯片技术采用原位合成或微矩阵点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽片段(甚至组织切片)、细胞等样品有序地固定在硅胶片或聚丙烯酰胺凝胶等支持物表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交，通过特定的仪器(如激光共聚焦扫描）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，判断样品中靶分子的数量，从而达到分析检测的目的[6]。

1.2 种类

生物芯片种类较多，根据芯片上固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片；根据原理还可分为元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片；以其片基不同分为无机片基和有机合成片基；按其应用不同可分为表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片；按其结构不同可分为DNA阵列和寡核苷酸芯片。目前应用较多、应用范围较广为基因芯片和蛋白质芯片。

1.2.1 基因芯片

基因芯片是根据核酸分子杂交衍生而来，即应用固体基因表面上集成已知序列的基因探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测，样品与探针杂交后，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，计算机系统对每一探针上的荧光信号作比较和杂交探针位置的检测，分析并得出结果，从而实现基因信息的快速检测[7]。

基因芯片的优点：可实现微生物的高通量并行检测，一次实验可得出全部结果；操作简便快速，整个检测只需4h基本可得出结果(而传统方法一般需4 d-7 d)；特异性强，敏感性高[8]。

1.2.2 蛋白质芯片

蛋白质芯片是利用蛋白质之间的相互作用，对样本中存在的特定蛋白质进行检测。即将位置和序列已知的蛋白以预先设计的方式固定在尼龙膜、玻璃、硅片等载体上，组成密集的分子排列，当荧光、免疫金等标记物的靶分子与芯片上的探针分子结合后，通过激光共聚焦扫描或光耦合元件对标记信号的强度进行检测，从而判断样本中靶分子的数量，以达到一次试验同时检测多种疾病或分析多种生物样品的目的[9]。

蛋白质芯片的优点：快速、定量分析大量蛋白质；使用简单，结果正确率较高，只需少量血样标本即可进行分析和检测；采用光敏染料标记，灵敏度高，准确性好；所需试剂少，可直接应用血清样本，便于诊断，实用性强。

2 应用

2.1 在食源性致病微生物快速检测中的应用

常见致病微生物如水产品中的霍乱弧菌、副溶血弧菌，奶制品、禽肉及其制品中的单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、SARS病毒、禽流感病毒等均可污染食品，导致多种疾病的爆发，严重威胁人类健康。然而，目前食源性致病微生物检测方法多为传统方法(主要是病毒分离培养和电镜观察)、免疫检测方法和以PCR为主的核酸检测方法，传统方法需经几天的微生物培养和复杂的计数，操作繁杂，灵敏度低；免疫检测法不能同时检测多种型，很难准确检定病毒，易造成漏检，同时灵敏度也不高；而PCR法快速，比前者灵敏，但成本高，假阳性多。这些方法很难满足食源性病菌检测的要求。

生物芯片技术具有高通量、高特异性和高灵敏度等优点，能满足食品安全检测的需求[10]。利用生物芯片进行食源性致病菌检测，主要包括以下步骤：1）样品前增菌：传统的样品前增菌方法需要48小时甚至更长时间，由于芯片灵敏度较高，常规的细菌只需培养8小时就可进行检测；2）核酸提取：采用快速提取方法在30分钟内就可完成核酸提取；3）核酸扩增：针对芯片的高通量检测，需建立高效的多重不对称PCR；4）芯片的杂交及检测。Wang等开发出可用于同时检测13个食源性致病菌的基因芯片技术，该技术检测灵敏度为l02cfu[]；Appelbaum在对几种细菌进行鉴别时，兼顾了基因序列的保守性（含有细菌所共有的16S rDNA保守序列）和各菌种间的差异性，设计了一种鉴别诊断芯片不仅敏感度高于传统方法，而且操作简单，重复性好。

2.2 在转基因食品检测中的应用

随着基因工程技术的迅速发展，转基因食品越来越多地出现在人们面前。但目前国际上还没有一份严肃的科学报告证实转基因食品永久安全。为加强对转基因作物以及相关食品的有效监管，保障公众的知情权，需要准确、高效的转基因食品检测手段。1999年10月，欧共体公布的转基因食品检测方法有酶联免疫吸附检测法和PCR法。但酶联免疫吸附检测法存在加热可能使某些成分变性的缺点；PCR法受多种因素的影响，容易交叉感染，造成假阳性等缺点，因此这两种方法有一定的局限性，不适合于对食品中大量不同转基因成分的快速检测。

生物芯片具有高通量、可并行检测的优点，仅一个实验就能筛选出大量各种转基因食品，被认为是最具潜力的检测手段之一。基因芯片检测方法主要包括以下步骤：1）基因芯片的制备：通常可以将目标靶序列、报告基因、启动子和终止子序列作为探针，排列在玻璃片或硅片载体上；2）待测样品的制备：需将待测样品DNA进行提取、扩增，并进行荧光标记；3）杂交反应：将荧光标记的待测样品DNA和芯片上的探针进行DNA分子杂交反应；4）对杂交反应后芯片上各个反应点的荧光信号进行检测，并通过相关软件进行数据分析[12]。刘烜等开发了检测转基因大豆的芯片，Leimanis等采用基因芯片技术同时检测9种转基因作物并提出该方法的检测限为0.1%。

2.3 在兽药残留检测方面的应用

近20年来，兽药在畜牧业中应用日益广泛，但兽药残留对人体造成多种危害(包括慢性、远期和蓄积性等)，如致癌、发育毒性、体内蓄积、免疫抑制、致敏等。

目前，兽药残留常规检测方法包括仪器法（如HPLC、GC/MS、LC/MS）、微生物法和酶联免疫法（ELISA、胶体金等）。仪器法仪器昂贵、试剂消耗量大、方法复杂、操作烦琐；微生物法检测灵敏度低、准确性差、检测速度慢；酶联免疫法可快速、高灵敏度、高准确度地检测样品，但每次检测只能针对单种兽药，初筛大量样品和日常监测工作则需要更简便快速的检测方法。

现已开发的兽药残留蛋白芯片检测平台，是根据抗原和抗体特异性结合的免疫学原理，采用荧光标记免疫竞争法测定样品中的兽药残留含量。通过化学方法在固相基质上固定多种蛋白偶联的兽药，蛋白质偶联的兽药和被检物中的兽药与兽药抗体竞争结合，溶液中未与芯片上蛋白偶联体结合的兽药抗体、游离兽药及二者的结合物在洗涤步骤中被除去，再加入荧光标记的二抗进行反应，再次洗涤后，通过芯片扫描仪扫描，立即获得分析结果。结果所反映的现象是荧光强度越高，样品中的兽药浓度越低。郭志红等[13]应用蛋白芯片检测鸡猪组织中磺胺二甲基嘧啶等4种兽药的残留，建立了灵敏度高、特异性强、集成化、微型化、高通量、方便快捷的兽药残留检测方法。

2.4 在动物疫病病原菌检测方面的应用

传统方法中多是利用免疫学方法或组织学方法对病毒或患病动物进行检测，检测指标单一，有时不能确定是何种病原体造成的感染，贻误治疗，造成疾病的传染。同时，对于大多数动物疾病而言，目前针对病原体的检测试剂还相当的少，大部分的疾病只能通过症状进行经验判断。

现已研制出马病病毒检测和犬病病毒检测的基因芯片，该芯片可以同时检测多种病毒，检测结果直接反应病毒的有无，直接而准确，且检测时间短，整个反应只需几个小时就能得到准确的结果。

2.5 在抗生素耐药检测中的应用

随着抗生素类药物的广泛应用，抗生素耐药问题已经成为日益严重的问题，而农产品所带来的耐药问题也日益突出，目前养殖行业还缺少对抗生素耐药检测的手段，药物的使用凭借经验用药和多抗生素混合用药，而带来一系列的问题如需要不断地寻找新药，用药成本日益增加，耐药菌越来越多等。生物芯片技术的产生将会给这个问题的解决带来新的途径。

基因芯片技术可从2个方面对病原体耐药性进行检测：1)在肿瘤中，通过检测肿瘤耐药基因表达变化分析耐药性；2)在病原体耐药性中，用表达谱芯片检测药物诱导的基因表达改变分析其耐药性，或用寡核苷酸芯片检测基因组序列的亚型或突变位点分析其耐药性[14]。

2.6 在食品安全领域其他方面的应用

在植物检疫性病原生物和害虫的检测方面，有关科学家研究了基因芯片技术在植物病害研究中的应用；也有人分析并预测了基因芯片在检疫性植物病原细菌、植物病毒、病原真菌、杂草、昆虫及线虫检测等方面的应用前景。

生物芯片技术还可应用于肉制品的动物种类成分鉴别和生物恐怖因子检测等。

3 技术障碍

鉴于生物芯片所显示出的巨大潜力和诱人商业前景，目前世界许多国家和地区已经相继开展了生物芯片的研制工作，但由于生物芯片应用性能不够理想而限制了使用。

限制生物芯片临床应用的一个很大障碍是检测灵敏度较低[15]。虽然通过借鉴医学免疫领域的荧光标记技术可提高其灵敏度，但传统的免疫检测技术需将所有检测程序一体化，而目前生物芯片技术却很难做到完全统一，其复杂的检测程序造成检测灵敏度较低。另外，提高生物芯片微阵列密度也是需攻克的技术障碍。微阵列密度越高，检测信息就越丰富。目前生物芯片技术可达到单片片基上3000个微阵列，每个微阱可容纳100纳升溶液。但理论上讲可达到lcm2芯片上分布100万个微阵列，这样检测通量会大大提高，因此对生物芯片的微细制备技术提出了更高的要求。

4 总结

生物芯片技术与食品安全检测相结合，必然会给生物芯片的应用以及食品安全检测水平的提高带来新的契机，带来检测速度的加快和检测费用的降低，大大加强执法机构如食品安全检测机构、出入境检验检疫局、商检局等的执法力度。虽然其在食品中的应用还没有普及，但是其蕴藏的潜力是惊人的。我们相信随着生物芯片技术逐步的发展和成熟，其在食品的生产、流通、检测等方面的应用必将越来越普遍。

食品质量的保证和提高，一方面需加强食品质量管理，另一方面也需加大食品安全检测力度。食品安全检测在食品经济中发挥的作用日益凸显，被誉为监视农牧渔业和食品工业生产的耳目，受到全社会的广泛关注[16]。现代科学技术为人们把好食品安全的责任关提供了诸多的方法，生物芯片技术是其中之一，作为一种新兴的生物技术，具有高效、大信息量和高特异性的优点，能够在很短时间内分析大量的生物分子，使人们能快速准确的获取样品中的多种信息，检测效率比传统的检测手段有了很大提高。

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