猪圆环病毒疫苗的研究进展

刘长明，陆月华，郭龙军，危艳武

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001）

猪圆环病毒疫苗的研究进展

刘长明，陆月华，郭龙军，危艳武

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、兽医生物技术国家重点实验室/猪传染病研究室，黑龙江哈尔滨 150001）

猪圆环病毒2型(PCV2）主要引起以患猪全身性淋巴结肿大为特征的多系统功能衰竭性疾病，临床上表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道疾病综合征、母猪繁殖障碍、坏死性淋巴结炎、肉芽肿性肠炎和渗出性表皮炎等，统称为猪圆环病毒病。本病于1991年在加拿大被发现，相继北美、欧洲、亚洲等几乎所有养猪国家均有本病流行的报道。由于PCV2与其他多种病原混合感染情况不尽相同，猪群发病后死亡率不等，较严重的地区暴病时死淘率高达40%，被公认为继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后，新发猪的重要传染病。我国猪群中PCV2感染十分普遍，流行病学调查表明，PCV2抗体阳性率高达80%以上，被调查的猪场阳性率达100%，尚未发现有抗体阴性猪场存在。PCV2感染途径主要以粪口为主，病毒先定殖于扁桃体，随血流进入周身淋巴结。在淋巴细胞中大量繁殖扩增，形成了不同程度的病毒血症。当病毒滴度高时，往往血清抗体滴度较低，临床上就会呈现明显的发病症状。大部分猪只在病毒感染后几周内会刺激产生高水平的抗体，抗体能够将病毒抗原中和，临床上表现为耐过康复。

一、PCV2的临床表现

根据病毒感染不同阶段猪后表现的临床症状有所不同，主要分为以下四种。

1.断奶仔猪多系统衰竭综合征。发生于5～12周龄保育猪，临床表现为进行性消瘦、呼吸急促、呼吸困难、黄疸、下痢、皮肤苍白和中枢神经失调等症状。病理变化为全身淋巴结肿大，淋巴器官的肉芽肿性炎症和不同程度的淋巴细胞缺失，解剖还可见肺斑点状出血。

2.猪皮炎肾病综合征。发生于2～4月龄生长猪，临床表现为多处局限性微凸出的暗红色病灶，此后迅速发热，直肠温度可达41℃以上，出现皮下水肿、厌食、体重减轻和抑郁等。通常病猪在3 d内死亡，死亡率约为20%。病理变化主要为出血性坏死性皮炎和动脉炎以及渗出性肾小球肾炎和间质性肾炎，出现腹水和心包积液。常与断奶仔猪多系统衰竭综合征同时爆发。

3.猪呼吸道疾病综合征。发生于16～22周龄生长猪和育肥猪，临床表现为生长迟缓、饲料利用率下降、嗜睡、厌食、发热、咳嗽和呼吸困难。组织病理学变化有支气管间质性肺炎，表现肺部广泛性的肉芽肿性炎症。

4.母猪繁殖障碍。临床表现为妊娠母猪流产、死产、木乃伊胎增多、断乳前死亡率上升。多数在妊娠晚期流产和娩出接近成熟的死胎或早产仔猪；在妊娠中期也会出现流产、木乃伊胎儿和早期胚胎死亡。病毒感染母猪受胎率降低或不孕，断奶前仔猪死亡率上升达10%以上，以垂直传播方式传播。

二、流行毒株变异

大量的流行病学研究表明，我国猪群中PCV2感染十分普遍。刘长明等（2007）采用免疫过氧化物酶单层细胞染色试验（IPMA）方法，对来自黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙、云南、江西等地猪场健康成年猪血清480份和发病猪血清424份进行了检测，抗体阳性率分别为91.7%和79.2%，送检样品的12个猪场均为阳性，表明PCV2在我国猪群中感染率非常严重。尽管PCV2抗体阳性检测率较高，但各猪场的发病率与死亡率差异较大，主要归因于猪场饲养技术水平不同，猪群中PCV2与混合感染的病原种类有很大关系。对发病猪场送检的病料检测，PCV2阳性样品中多数与高致病PRRSV变异株混合感染，在保育阶段仔猪死亡率达50%以上。范培虎等用发生高热症猪场分离的PCV2和PRRSV变异毒株进行本动物感染试验，试验分为单独感染PCV2、PRRSV，两种病毒同时或先后顺序感染组。PCV2、PRRSV单独感染组与混感感染组对比，后者出现更为严重的临床症状，先感染PRRSV一周后再感染PCV2试验组，出现了高达60%的死亡率，基本能够再现发病猪场的状况。这些研究表明，目前在我国猪群中，PCV2与PRRSV混合感染是造成养猪业严重损失的主要原因。郭龙军等（2009）对我国10个省份不同地区送检的90份病料中分离到19株PCV2流行毒株。通过病毒基因组克隆和测序，将19株病毒分为2个大基因群和3个亚群：PCV2a、PCV2b、PCV2d；其基因组构成依次为1766nt、1767nt和1768nt，各占15.8%、73.7%和10.5%。若以1767nt毒株为基准，其第39或1039位有1个碱基缺失后突变成1766nt毒株；第1040位有1个碱基插入后突变成1768nt毒株。对19株病毒ORF2编码的Cap蛋白分析发现，有4株病毒编码基因发生了突变，出现了705nt和708nt两种突变型，使ORF2编码的Cap蛋白C末端分别有1和2个氨基酸延伸。研究表明，我国猪群中流行的PCV2以PCV2b亚型流行毒株为主。Harding等分别用PCV2a和PCV2b亚型毒株接种试验猪，证明两种类型毒株在毒力上无明显差异。

三、国外PCV2疫苗

国外对PCV2做了大量研究，Blanchard等对PCV2基因疫苗与灭活疫苗的免疫效力进行了比较，证明基因疫苗可诱导机体免疫保护，单独用PCV2基因疫苗2次免疫的效果低于灭活疫苗，灭活疫苗能完全抑制PCV2的增殖。Fenaux等用灭活苗免疫猪可刺激产生特异性抗体，减少病毒血症的发生，有效地阻止肺部病变。国外商品化疫苗中，勃林格殷格翰公司研制的PCV2亚单位疫苗，将PCV2 ORF2基因插入到昆虫杆状病毒，用昆虫细胞培养获得的重组PCV2 Cap蛋白制备亚单位疫苗；该疫苗免疫组猪平均死亡率为2.4%，对照组死亡率为9.5%。先灵葆雅公司研制的PCV2灭活疫苗，在加拿大22个猪场进行的多中心随机试验，在保育和肥育期未接种疫苗对照组平均死亡率为9.3%，疫苗免疫组为2.1%。法国梅里亚公司研制的PCV2全病毒灭活苗用于母猪免疫，在多个国家试验表明，疫苗免疫母猪群获得了群体性免疫力，仔猪可从初乳中获得母源抗体，在5周内能够有效预防PCV2感染。美国富道公司开发的Suvaxvn PCV1/PCV2重组灭活疫苗，在6个猪场临床试验，在生长/肥育期未接种疫苗对照组平均死亡率为7.7%，疫苗免疫组死亡率为1.8%。总之，国外研制的PCV2疫苗均取得良好免疫效果，疫苗售价也十分昂贵，每头份达5～10美元。

四、国产PCV2疫苗的研制

我国对PCV2疫苗研究起步较晚，一直没有商品化疫苗问世。针对该病的流行态势及危害的严重性，尽快研制出适合国情的疫苗非常必要，市场需求十分迫切。鉴于PCV2基因组构成简单，病毒变异幅度较小，通过细胞传代很难达到完全致弱，且弱毒疫苗容易造成因毒力反强引起疫病再流行。灭活苗是经细胞培养大量增殖病毒，加入灭活剂将病毒杀死，具有安全性好、便于贮存运输和抗母源抗体干扰等优点。此外，当今人们更加关注能够设计出一种具有带有分子标识的疫苗，随着科学技术的进步，采用感染性分子克隆技术构建标记毒株成为可能。PCV2感染细胞不易产生致细胞病变，常规病毒学操作很难达到病毒克隆纯化，构建PCV2感染性分子克隆获得具有分子标识的毒株，为疫苗毒株与野生毒株间的鉴别诊断奠定了基础。我们采用国内自行分离的毒株，采用感染性分子克隆技术获得了具有分子标记毒株作为毒种，经细胞培养传代，培育成功一株体外培养适应毒株，对病毒繁殖规律、毒价测定、血清学检测、形态学鉴定、核酸序列分析、动物感染模型、疫苗生产工艺、佐剂筛选、动物免疫安全性及免疫效力等进行了系统试验，研制成功我国首例PCV2灭活疫苗，种毒获得国家发明专利，疫苗获得国家二类新兽药证书，并转让给两家企业投入生产。为配合疫苗免疫效果评价，研制成功配套血清抗体检测试剂盒。该成果为我国有效防控本病的流行提供了技术手段。本成果拥有自主知识产权，属于原始创新。

五、国产疫苗特点

国产疫苗采用无PCV1猪肾传代细胞系培养增殖病毒，病毒液经甲醛溶液灭活后，与进口佐剂混合乳化而成，用于预防PCV2感染猪只引起的相关疾病。研制的疫苗具有如下特点。(1）构建的感染性分子克隆毒株，在基因组内插入了一个分子标签，可用PCR-RFLP与野生型毒株相鉴别。(2）疫苗毒株经细胞培养传60代，繁殖性能稳定，毒价达106.6 TCID50/ml，制备的疫苗抗原含量高。(3）病毒灭活后排除了再感染靶动物的能力，安全性好。(4）采用进口的水包油剂型佐剂，接种后刺激机体产生抗体快、效价高。(5）疫苗对任何品种、年龄的健康猪群接种后无任何毒副作用。（6）疫苗免疫猪攻毒保护率达96%以上，免疫期为6个月。（7）疫苗抗母源抗体干扰强，不受母源抗体的影响，能够完全抵抗病毒感染。（8）临床应用效果显著，在全国175个规模化养猪场推广应用统计，没有1个猪场出现应激反应，平均死亡率降低8%，平均出栏率提早5～7 d，药物使用量减少30%，每头猪节约成本50元。（9）与进口疫苗对比，主要性能指标相当，售价仅为进口产品1/3，为养猪业节约大量疫苗费用。（10）配套的血清抗体检测诊断试剂盒，为疫苗免疫效果评价提供了手段。

略）